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iPSC研究兩大神器！不允許你不知道
?誘導(dǎo)多能干細胞（iPSC，簡稱為iPS細胞），是一種由哺乳動物成體細胞經(jīng)轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)錄因子等手段脫分化形成的多能干細胞，最早由日本學(xué)者山中伸彌的研究團隊于2006年發(fā)現(xiàn)。作為研究發(fā)育或疾病分子機制的理想研究工具，識別新治療靶點和高通量藥物篩選方面的廣闊應(yīng)用[1]。
雖然iPSC研究已經(jīng)取得長足進步，但在后續(xù)的研究過程中，仍存在一些挑戰(zhàn)。誘導(dǎo)iPSC生成的過程中，效率低、致瘤性、外源基因插入等問題仍然存在，iPSC誘導(dǎo)向人體組織細胞的過程中也存在成熟度不足、致瘤性風(fēng)險等問題，需要培養(yǎng)方法的優(yōu)化以及對重編程分子機制的進一步研究。要解決這一系列問題，必須通過高通量的研究發(fā)現(xiàn)新的靶點和培養(yǎng)及誘導(dǎo)方法，Incucyte® 實時活細胞分析系統(tǒng)和iQue® 高通量流式細胞儀可以滿足高通量研究的需求，為iPSC研究插上騰飛的翅膀。
Incucyte® iQue®
Incucyte® 在iPSC研究中的應(yīng)用
工欲善其事，必先利其器。在iPSC的研究過程中，在不挪動細胞的前提下，Incucyte® 可以實現(xiàn)長時間實時監(jiān)測iPSC向特定細胞類型分化的整個分化過程中細胞特征的變化，包括細胞形態(tài)、增殖、凋亡等指標(biāo)，并且一次可放6塊培養(yǎng)板，滿足高通量活細胞成像的要求。
iPSC研究大致有兩個方向：
1 優(yōu)化培養(yǎng)條件、誘導(dǎo)體系等以期獲得更穩(wěn)定的iPSC細胞系；iPSC細胞呈現(xiàn)克隆生長，為確定不同iPSC細胞系，哪種在后續(xù)基因編輯以及誘導(dǎo)中更加穩(wěn)定，對各個細胞系實時監(jiān)測，通過匯合度計算增殖情況[7]。
圖1. 候選細胞系的增殖特征：
A：Incucyte® 記錄不同iPSC細胞系傳代三天后的圖片；B：3×104 個細胞接種48h細胞消化計數(shù)；C：使用Incucyte® 計算3個時間點匯合度（confluence）來評估iPSC增殖情況
2 模擬疾病模型以及分化出更成熟的成體組織細胞，包括優(yōu)化誘導(dǎo)條件以及改為3D培養(yǎng)等。下面兩篇文獻的Figure展示了向神經(jīng)以及心肌細胞方向的分化：
圖2. 體外培養(yǎng)20天的分化神經(jīng)熒光細胞簇：
在iPSC向神經(jīng)細胞分化的過程中，用βIII-tubulin (TUJ1) 對未成熟神經(jīng)元的聚集體進行染色，并顯示從(a)陰性對照聚集體、(b)未加載的微球結(jié)合聚集體、(c)微球結(jié)合聚集體和(d)陽性對照聚集體[8]。Incucyte® 自動拍攝36張單獨圖像組合而成，用 ImageJ 軟件拼接和裁剪。比例尺：300 μm。
圖3. hiPSC-CM 實時凋亡信號檢測
心肌分化，作者利用一種新的Metabolic Selected的誘導(dǎo)選擇方法制備缺血性心肌病模型的心肌細胞，這種模型的心肌細胞應(yīng)具備Dox毒性敏感特征。利用我們的活細胞凋亡指示劑[9]實時檢測在加入Dox后心肌細胞的死亡情況發(fā)現(xiàn)Annexin V+的細胞比例隨Dox濃度提升死亡比例上升。
iQue® 在iPSC研究中的應(yīng)用
除Incucyte® 的應(yīng)用外，高通量的研究當(dāng)然少不了我們的iQue® 高通量流式細胞儀，專為大規(guī)模篩選設(shè)計。
2020年時，阿斯利康改良Crisper-cas9技術(shù)，開發(fā)了一種ObLiGaRe強力霉素誘導(dǎo)型SpCas9(ODInCas9)轉(zhuǎn)基因小鼠模型，靶向ObLiGaRe導(dǎo)致人類或小鼠細胞的功能整合，最終產(chǎn)生ODInCas9小鼠，并且驗證發(fā)現(xiàn)這種小鼠體細胞體內(nèi)編輯可以模擬非小細胞肺癌 (NSCLC) 腺癌，使治療研究能夠驗證候選藥物的功效。在判斷基因編輯成功與否時，應(yīng)用到Incucyte® 檢測細胞增殖，并聯(lián)合使用iQue® 及Incucyte® 篩選GFP陽性的細胞[10]。
圖4. 高通量篩選編輯成功的GFP陽性細胞：
將各種不同組織細胞以及iPSC細胞導(dǎo)入OdInCas9，抗生素篩選后進行單克隆挑選培養(yǎng)，用Incucyte® 拍照成像，識別GFP陽性細胞，為確定是否真正導(dǎo)入OdInCas9，加入Dox誘導(dǎo)GFP表達，細胞消化后放入96孔板，用我們的iQue® 鑒別GFP陽性細胞。
除此之外， 賽多利斯對兩者在iPSC中的應(yīng)用做了一個簡單的示例（圖5）：
圖5. iPSC檢測實驗流程：
1.多能性檢測：iQue® 檢測iPSC細胞系多能性標(biāo)記基因表達并用Incucyte® 檢測細胞形態(tài)；
2.2D培養(yǎng)時，利用Incucyte® 拍照，iQue® 檢測表面標(biāo)記基因表達；
3.3D培養(yǎng)21天后，以同樣方法檢測。
而下圖就是一個很好的案例。
圖6. 優(yōu)化培養(yǎng)基長期培養(yǎng)特征評估：
我們加入一種基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及一種優(yōu)化培養(yǎng)基培養(yǎng)ATCC-DYS0100 iPSC細胞系，并檢測這兩種情況下的生長狀況、形態(tài)以及標(biāo)記基因表達（圖5），可以看到陰性對照（非多能細胞）THP1細胞表達高水平SSEA-1，低表達TRA-1-60，陽性對照NCCIT細胞恰恰相反（圖6 A），優(yōu)化過培養(yǎng)基在長期培養(yǎng)到18天時，仍然保持著很強的多能性，而非優(yōu)化培養(yǎng)基隨著時間推移，逐漸分化。Forecyt分析軟件*的熱圖結(jié)果，清晰地展示18天時多能性標(biāo)記基因的表達比例（圖6 B），從而方便地實現(xiàn)大規(guī)模篩選。Incucyte® 對培養(yǎng)的擬胚體進行觀察，發(fā)現(xiàn)優(yōu)化過的細胞偏心度遠低于未優(yōu)化組，更加圓潤（圖6 C,D），證明優(yōu)化過的培養(yǎng)基對于多能性的維持作用明顯。
展望未來，利用iPSC這種理想研究工具，可從成千上萬種的藥物中，發(fā)現(xiàn)藥物的新靶點、新作用，乃至發(fā)現(xiàn)新的藥物，誘導(dǎo)出真正替代人體成體細胞成熟度的細胞。
為什么要用Incucyte®長時程細胞影像分析系統(tǒng)？
iPSC異質(zhì)性強對培養(yǎng)條件要求苛刻，培養(yǎng)箱內(nèi)可長達數(shù)周的連續(xù)觀察，最短幾分鐘間隔拍攝，減少人力，防止過多操作對細胞的傷害
6個板位，分別獨立設(shè)置檢測程序，可以兼容各種孔板和培養(yǎng)皿，通量高
高效簡便的模塊化軟件設(shè)置和數(shù)據(jù)分析，輸出圖片、視頻、生長曲線等多指標(biāo)多參數(shù)；本文提到了使用Incucyte® 多個參數(shù)的調(diào)節(jié)，使得結(jié)果更加準確
大于100種優(yōu)化過的活細胞專用熒光試劑、耗材及詳盡的Protocol；文章數(shù)大于12000篇，是長時間活細胞成像產(chǎn)品中最多
為什么要用iQue® 高通量流式呢？
最小樣本體積達到10uL，支持384、1536孔板采樣，96孔板只需5min
ForeCyt軟件、比起傳統(tǒng)流式更簡單的使用及維護，硬件配套軟件，是高通量流式篩選必備儀器。雖然在文章中未提及iQue® 的高通量應(yīng)用
《活細胞監(jiān)測：優(yōu)化高級細胞模型的工作流程》
參考文獻
[1]Ding M, Clark R, Bardelle C, et al. Application of High-Throughput Flow Cytometry in Early Drug Discovery: An AstraZeneca Perspective[J]. SLAS discovery: advancing life sciences R & D, 2018, 23(7): 719–731.
[2]Zhou M, Wang H, Zeng X, et al. Mortality, morbidity, and risk factors in China and its provinces, 1990–2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017[J]. The Lancet, Elsevier, 2019, 394(10204): 1145–1158.
[3]Takahashi K, Yamanaka S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors[J]. Cell, 2006, 126(4): 663–676.
[4]Generation of human-induced pluripotent stem cells - PubMed[EB/OL]. /2022-09-30. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18600223/.
[5]Liu G, David B T, Trawczynski M, et al. Advances in Pluripotent Stem Cells: History, Mechanisms, Technologies, and Applications[J]. Stem Cell Reviews and Reports, 2020, 16(1): 3–32.
[6]Kim J, Koo B-K, Knoblich J A. Human organoids: model systems for human biology and medicine[J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2020, 21(10): 571–584.
[7]Pantazis C B, Yang A, Lara E, et al. A reference induced pluripotent stem cell line for large-scale collaborative studies[J]. bioRxiv, 2022: 2021.12.15.472643.
[8]Agbay A, Vega L D L, Nixon G, et al. Guggulsterone-releasing microspheres direct the differentiation of human induced pluripotent stem cells into neural phenotypes[J]. Biomedical Materials, IOP Publishing, 2018, 13(3): 034104.
[9]Davis J, Chouman A, Creech J, et al. In vitro model of ischemic heart failure using human induced pluripotent stem cell–derived cardiomyocytes[J]. JCI Insight, , 6(10): e134368.
[10]Lundin A, Porritt M J, Jaiswal H, et al. ObLiGaRe doxycycline Inducible (ODIn) Cas9 system driving pre-clinical drug discovery, from design to cancer treatment[R]. Genomics, 2020.