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Cat#:10126 冰袋運輸 &保存方式詳見各組分 |
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動物組織直接PCR試劑盒 Animal Tissue Direct PCR Kit | |
使用手冊V1.1
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本產品僅作科研用途！ 上海翊圣生物科技有限公司 ：4006-111-883 : order@yeasen.com | |
產品信息
產品名稱 | 產品編號 | 規格 | 價格（元） |
Animal Tissue Direct PCR Kit 動物組織直接PCR試劑盒 | 10126ES50 | 50T | 326.00 |
Animal Tissue Direct PCR Kit 動物組織直接PCR試劑盒 | 10126ES70 | 200T | 1236.00 |
產品描述
動物組織直接PCR試劑盒是一種可直接對不同動物組織進行PCR擴增的試劑盒，適應性廣、穩定性強。試劑盒中采用*的裂解緩沖液體系，可以簡便快速的裂解多種動物組織樣品并釋放出基因組DNA。整個過程不需要除去蛋白、RNA及其它次生代謝物，也無需有機溶劑抽提，即可得到質量穩定的基因組DNA，無需后續純化步驟即可直接用于PCR反應。而且樣品需求量小，少到5mg動物組織即可進行實驗。
試劑盒中提供的 2×Tissue Master Mix 具有很強的擴增兼容性，能直接以待測樣品裂解液為模板，進行高效特異性擴增。該試劑為2倍濃縮PCR反應混合物，包含了用于PCR擴增除模板和引物外的所有組分，并以dUTP替代了dTTP，另外加入了能夠降解含有dUTP 模板的 UNG 酶(Uracil-N-glycosylase)。在PCR反應前，利用UNG酶降解含有尿嘧啶的PCR產物，UNG 酶對不含有尿嘧啶的模板不會造成任何影響，從而保證擴增的特異性和準確性，防止了大規?；驒z測時可能出現的PCR產物污染問題。優化的2×Tissue Master Mix與直接裂解液配合使用能夠快速簡便地對樣品進行檢測，并具有靈敏度高、兼容性強、特異性強、穩定性好等特點。
該試劑盒可用于轉基因型鑒定、動物基因分型等多種大規模基因檢測。
產品組分
編號 | 組分 | 產品編號/規格 | 儲存 | |
10180ES50（50T） | 10180ES70（200T） | |||
10180-A | 2 × Tissue Master Mix* | 500 μl | 1 ml×2 | -20℃ |
10180-B | Buffer AL | 5 ml | 20 ml | 室溫或4℃ |
10180-C | Protease | 220 μl | 880 μl | 4℃ |
10180-D | 6× DNA Loading Buffer | 1.5ml | 1.5ml | 4℃ |
*2 × Tissue Master Mix中包含Tissue Taq DNA 聚合酶、UNG酶、dNTP（dUTP替代了dTTP）、MgCl2、反應緩沖液、PCR反應增強劑、優化劑和穩定劑。
運輸方法
冰袋（wet ice）運輸。
保存方法
① 本試劑盒的10180-A【2×Tissue Master Mix】保存在-20℃，避免反復凍融。
② 10180-B【Buffer AL】在常溫干燥條件下，可保存12個月，如需保存更長時間可置于4℃。
③ 10180-C【Protease】溶液具有*配方，常溫保存（25℃）可長期具有活性，在4℃保存，其活性和穩定性會更好，因此建議將其置于在4℃保存，請勿置于-20℃保存。
注意事項
1）本試劑盒適用于常規PCR，請勿用于多重PCR鑒定；建議擴增片段在1kb以內。
2）注意實驗用具的清潔以及實驗的操作手法，避免樣本間的交叉污染。
3）建議采用新鮮采取的動物組織，若為長期冷凍組織，應盡量避免反復凍融，否則會導致模板的降解，影響PCR效率。
4）Buffer AL若低溫保存，容易產生沉淀。在使用前務必將其在室溫中放置一段時間，也可在37℃水浴中預熱10min，以溶解沉淀，混勻后再使用。
5）電泳檢測時，切勿使用含有 SDS 的 Loading Buffer，否則在電泳時會在泳道中出現一大團拖尾亮帶，影響實驗結果。
6）建議設立陽性及陰性對照反應。陽性對照可用50ng純化的動物DNA為模板，陰性反應以ddH2O為模板，引物可采用以前成功擴增的引物。
7）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
操作方法
1. 取5-10mg動物材料，置于離心管中。盡量剪碎動物材料，以使之后的酶解反應容易進行。
2. 取100μl Buffer AL并加入4μl Protease，渦旋混勻。
3. 向混合液中加入動物組織，渦旋混勻。
4. 65℃孵育10-30min，然后95℃處理5min。
【注】：65℃孵育，一般只需10min即可滿足多數PCR需求。若需要的DNA量較大或樣品較難酶解，可以將時間延長至30min。組織塊不需*酶解，殘余的部分在后續離心步驟中可被除去。
5. 12,000 rpm (~13,400×g )離心5min。
6. 轉移上清至新的離心管，4℃或-20℃放置備用或直接用于PCR擴增。
【注】：用于后續PCR檢測時，模板量占PCR體系的1-10%之間，不能超過20%。如50μl 的PCR體系中，加入0.5-5μl 裂解液即可，但不能超過10μl。
7. PCR反應體系配制*
按照下表配制PCR反應體系，配置好反應體系后，短暫渦旋充分混勻并瞬時離心，將所有試劑收集到管底。
ddH2O | Up to 20μl |
2 × Tissue Master Mix | 10μl |
正向引物（10μM） | 0.5μl |
反向引物（10μM） | 0.5μl |
模板 DNA | xμl |
【*】：① 配制的PCR反應體系可根據所需終體系（如50μl）按照該比例進行調整。
② 通常引物終濃度為0.2-0.25μM可以得到較好結果。反應性能較差時，可以在0.1-0.5μM范圍內調整引物濃度。
8. PCR反應條件設置
此表PCR反應條件僅供參考。PCR反應條件因模板、引物等的結構條件不同而各異。具體操作中需要根據模板類型、目的片段大小、擴增片段的堿基序列和引物的GC含量及長短等具體情況來優化的反應條件，包括退火溫度，延伸時間等。
循環步驟 | 溫度 | 時間 | 循環數 |
UNG酶處理 | 50℃ | 5min | 1 |
滅活UNG酶&預變性 | 94℃ | 5min | 1 |
變性 | 94℃ | 10sec | 30-40循環 |
退火a | 50-65℃ | 20sec | |
延伸b | 72℃ | 30 sec/kb | |
*延伸 | 72℃ | 5min | 1 |
【注】：a. PCR程序中的退火溫度需根據引物的Tm值自行設置；
b. 延伸時間需要根據片段的長度來確定，對于1kb以內的DNA片段，建議延長時間為30sec。
常見問題與解答
常見問題 | 分析原因 | 解決方式 |
陽性對照、待測樣本均無條帶 | PCR反應體系或反應條件不合適。 | 使用梯度PCR 摸索反應條件。 |
PCR 試劑保存不當失去活性。 | 2 × Tissue Master Mix應保存于-20℃，使用時避免反復凍融。若使用頻繁，可在4℃短時間存放。確保在10天內用完。 | |
引物設計問題。 | 嘗試重新設計引物進行檢查。 | |
陽性對照有目的條帶，待測樣本無條帶或條帶弱 | 加入組織裂解液過量。 | 增大反應體系，或減少裂解液的用量。 |
樣本裂解混合液保存不當或保存時間過久，DNA基因組已被降解。 | 裂解混合液液可于4℃保存 2-3 天，盡量使用新鮮制備的裂解混合液進行 PCR。 | |
模板加入量不適合。 | 在反應體系 10-20%范圍內優化模板加入量。反應效性能較差時，可以將模板濃度調節到低于10%的范圍。 | |
PCR 循環數不足。 | 適當增加 PCR 的循環數，35-40 循環為佳。因為模板復雜，一般PCR反應要比用純化的 DNA 模板多 5-10 個循環為佳。 | |
非特異性擴增 | 退火溫度偏低。 | 適當提高退火溫度?；驅ν嘶饻囟茸鲆粋€梯度摸索。 |
PCR 循環數過多。 | 適當降低循環次數，推薦在 35-40 循環為佳。 | |
引物濃度偏高。 | 適量降低引物用量。通常引物終濃度為 0.2μM 可以得到較好結果。反應性能較差時，可以在0.1-0.5μM 范圍內調整引物濃度。 | |
模板加入量過多。 | 將模板加入量控制在10-20%。反應效性能較差時，可以降模板濃度調節到低于 10%的范圍。 | |
空白對照出現目的條帶 | 操作工具或試劑污染。 | 實驗所有試劑或器材均應高壓滅菌。操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。 |
樣本間交叉污染。 | 每個取樣器只對一個樣本使用；或取完一個樣本后，將取樣器刃口浸入 2%的次氯酸鈉溶液中，反復涮洗，然后用干凈的紙巾擦干殘液。 |
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