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產(chǎn)品簡(jiǎn)介

RNase活性檢測(cè)試劑盒（熒光標(biāo)記法）使用一種新型RNA底物，其一端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)分子(Fluor)，另一端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)。在不存在RNase時(shí)，淬滅基團(tuán)的物理接近會(huì)將熒光報(bào)告基團(tuán)中的熒光淬滅到極低水平。當(dāng)有RNase時(shí)，RNA底物被水解，熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)在溶液中的空間上發(fā)生分離，這導(dǎo)致Fluor在被適當(dāng)波長(zhǎng)的光激發(fā)時(shí)發(fā)出明亮的熒光，該熒光可以通過多功能酶標(biāo)儀（含熒光模塊）和基于濾光片或單色器的熒光計(jì)進(jìn)行檢測(cè)。

RNase活性檢測(cè)試劑盒（熒光標(biāo)記法）采用底物熒光標(biāo)記法，可定量或定性的檢測(cè)單個(gè)樣品中的RNase，從而判斷樣本是否有RNase污染。

產(chǎn)品信息

組分信息

運(yùn)輸和儲(chǔ)存條件

1. 所有組分均干冰運(yùn)輸，有效期1年。

2. 收到貨后，請(qǐng)先檢查共5個(gè)組分是否齊全，再將41309-E組分2-8℃保存，其它組分-25~-15℃保存，避免反復(fù)凍融。

注意事項(xiàng)

1. 本產(chǎn)品僅作科研用途。

2. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套操作。

3. 使用本試劑前請(qǐng)仔細(xì)閱讀本說明書，實(shí)驗(yàn)應(yīng)規(guī)范操作，包括樣本處理、反應(yīng)體系的配制及加樣。

4. 每個(gè)組分在使用前都應(yīng)充分震蕩混勻，低速離心。

5. 加樣和配液步驟請(qǐng)嚴(yán)格在冰上操作，以減緩上機(jī)前酶對(duì)底物的消耗。

6. 實(shí)驗(yàn)需使用低吸附耗材以降低酶損耗。

7. 定量實(shí)驗(yàn)需使用黑色酶標(biāo)板以減少本底熒光。

使用說明

1. 適用機(jī)型

包含但不限于以下儀器：

Thermo Scientific: Invitrogen Qubit 4;

Molecular Devices: SpectraMax M3.

2. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

1）在整個(gè)實(shí)驗(yàn)開始前，請(qǐng)先使用試劑盒中的Surface RNase Remover對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境進(jìn)行處理（可稀釋10倍進(jìn)行噴灑或擦拭，具體可參考翌圣10609ES60使用說明書），以降低RNase污染。

2）本品可對(duì)具備活性的RNase進(jìn)行檢測(cè)及估值，在實(shí)驗(yàn)過程中可根據(jù)實(shí)際情況選擇定性檢測(cè)或者定量檢測(cè)方法。

3. 定性檢測(cè)方法

使用終點(diǎn)法在熒光儀或酶標(biāo)儀上對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行讀數(shù)，以Thermo公司Invitrogen Qubit 4熒光儀為例：

1）溶解RNase Substrate：取1管RNase Substrate干粉，高速離心，緩慢打開瓶蓋加入1 mL DEPC-treated Water備用。

2）配制反應(yīng)體系：每次實(shí)驗(yàn)均需制備陰性對(duì)照、陽性對(duì)照和待測(cè)樣本體系。具體操作如下（按順序加入下列試劑并混勻）：

表1 陰性對(duì)照反應(yīng)體系

表2 陽性對(duì)照反應(yīng)體系

*試劑盒C組分的RNase A參考品稀釋20倍約為5 pg/μL的RNase A。

表3 待測(cè)樣本反應(yīng)體系

*若待測(cè)樣本污染較輕可增加待測(cè)樣本體積，最大可增加至160 μL，相應(yīng)減少DEPC-treated Water添加量，最小可減少至0，保持總體積不變。

3）檢測(cè)初始熒光值：以Qubit4為例，對(duì)陰性對(duì)照、陽性對(duì)照和待測(cè)樣本進(jìn)行檢測(cè)，選擇“Fluorometer"進(jìn)入熒光檢測(cè)界面后，再選擇“Blue"進(jìn)行檢測(cè)，并記錄初始熒光值“RFU0"。

4）37℃孵育讀值：將陰性對(duì)照、陽性對(duì)照和待測(cè)樣本均放入37℃恒溫箱孵育60 min后，重復(fù)步驟3，記錄終末熒光值“RFU60"。5）結(jié)果判讀：若陰性對(duì)照熒光值孵育前后變化不超過50%，陽性對(duì)照RFU60遠(yuǎn)大于2RFU0，且待測(cè)樣本RFU60≥2RFU0，則判定待測(cè)樣本被RNase污染。

4. 定量檢測(cè)方法

使用多功能酶標(biāo)儀對(duì)RNase進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)并定量，使用此方法可以獲得RNase消化底物的實(shí)時(shí)曲線。以Molecular Devices公司SpectraMax M3多功能酶標(biāo)儀為例：

1）溶解RNase Substrate*：取1管RNase Substrate干粉，高速離心，緩慢打開瓶蓋加入1 mL DEPC-treated Water備用，該干粉加入DEPC水后，可分裝置于-25~-15℃短期保存（不超過3個(gè)月），使用時(shí)避免反復(fù)凍融。

2）稀釋RNase A**：對(duì)試劑盒中RNase A梯度稀釋，濃度依次為5 pg/μL、2.5 pg/μL、1 pg/μL、0.1 pg/μL。操作如下：

a. 取1.5 mL潔凈離心管，加入495 μL DEPC-treated Water，再加入5 μL 10×RNase buffer，即獲得500 μL 0.1×RNase buffer，用于后續(xù)配置梯度稀釋液，配置前請(qǐng)將溶液輕微振蕩混勻。

b. 取5支潔凈的1.5 mL離心管，分別標(biāo)記為Std0、Std1、Std2、Std3、Std4。

c. 在標(biāo)記為Std0***的1.5 mL離心管中加入45 μL 0.1×RNase buffer和5 μL試劑盒中提供的RNase A(≈1×10-4 U/μL)，即稀釋為10 pg/μL（≈1×10-5 U/μL）的RNase A。

d. 在Std1、Std2、Std3、Std4管中先分別加入下表所示體積的0.1×RNase buffer，再進(jìn)行梯度稀釋，具體稀釋方法如下：

表4 標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋

*為減少反復(fù)凍融次數(shù)和避免污染，建議初次使用時(shí)將稀釋好的RNase Substrate分裝儲(chǔ)存于-25~-15℃。

**已知試劑盒中的RNase A濃度為≈1×10-4 U/μL，且對(duì)于RNase A的單位U和pg的換算關(guān)系為5×10-7 U≈0.5pg。

***Std0配制：將試劑盒中RNase A由1×10-4 U/μL稀釋至1×10-5 U/μL，因5×10-7 U≈0.5pg，則1×10-5 U≈10pg，故1×10-5 U/μL≈10pg/μL。

3）標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣本的反應(yīng)體系配制：

a. 標(biāo)準(zhǔn)品和陰性對(duì)照的Mix混合液配制：通常包括4個(gè)濃度梯度的RNase A參考品標(biāo)準(zhǔn)曲線和1個(gè)無模板對(duì)照NTC共5個(gè)樣本，每個(gè)樣本2個(gè)重復(fù)孔，再加1孔的損失量，共計(jì)11個(gè)孔。具體操作如下（按順序加入下列試劑并混勻）：

表5 Mix混合液配制體系

標(biāo)準(zhǔn)品和陰性對(duì)照反應(yīng)體系配制：將上述配制的Mix混合液以90 μL/孔進(jìn)行分裝，再添加10 μL/孔稀釋好的RNase A參考品或10 μL/孔的陰性對(duì)照（可用0.1×RNase buffer作為陰性對(duì)照）。具體操作如下：

表6 標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)體系

表7 陰性對(duì)照反應(yīng)體系

b. 待測(cè)樣本反應(yīng)體系配制（按順序加入下列試劑并混勻）：

表8 待測(cè)樣本反應(yīng)體系

*若待測(cè)樣本污染較輕可增加待測(cè)樣本體積，最大可增加至80 μL（待測(cè)樣本的本底檢測(cè)與之保持一致），相應(yīng)的減少DEPC-treated Water添加量，最小可減少至0，保持反應(yīng)體系總體積不變。

c. 待測(cè)樣本的本底檢測(cè)反應(yīng)體系配制：

表9 待測(cè)樣本的本底反應(yīng)體系

*建議每次進(jìn)行RNase活性檢測(cè)時(shí)，針對(duì)每個(gè)初次測(cè)試的待測(cè)樣本都增加不含RNase Substrate的本底熒光檢測(cè)，若本底熒光偏高則計(jì)算時(shí)應(yīng)減去。

**每次進(jìn)行RNase活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對(duì)照、待測(cè)樣本、待測(cè)樣本的本底檢測(cè)等都至少做2個(gè)重復(fù)孔。

***為確保檢測(cè)的準(zhǔn)確性，所有樣本進(jìn)行加樣時(shí)，請(qǐng)務(wù)必在冰上操作。

4）下表為參考板位：

表10 上機(jī)參考板位

該示例是對(duì)RNase活性檢測(cè)的熒光標(biāo)記法的操作展示，檢測(cè)樣本包括：4個(gè)濃度梯度的RNase A標(biāo)準(zhǔn)曲線、1個(gè)無模板對(duì)照NTC、8個(gè)待測(cè)樣本TS、8個(gè)待測(cè)樣本對(duì)應(yīng)的本底檢測(cè)。建議每個(gè)樣本做2個(gè)重復(fù)孔。

5）儀器設(shè)置：使用酶標(biāo)儀進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)，選擇96孔板動(dòng)力學(xué)模式以及熒光檢測(cè)模塊，選擇中等增益，設(shè)置激發(fā)光490 nm，發(fā)射光520 nm；以1 min間隔讀取數(shù)據(jù)，37℃恒溫連續(xù)讀數(shù)1 h（視待測(cè)物污染情況而定），此方法可實(shí)時(shí)監(jiān)控體系動(dòng)態(tài)。

6）結(jié)果判讀：

a. 若RFU60≥2RFU0，則判定待測(cè)樣本被RNase污染。

b. 若判定樣本已污染，則制作標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)待測(cè)樣本RNase污染含量（以下示例顯示總體系的污染含量，如：標(biāo)準(zhǔn)品5 pg/μL，加樣量10 μL，即總體系含量50 pg）：

c. 以標(biāo)準(zhǔn)品開始讀數(shù)時(shí)的前幾分鐘（可從時(shí)間曲線上判斷線性增長(zhǎng)期并選擇合適的時(shí)間點(diǎn)，如下圖一般選擇0-3 min）所得數(shù)據(jù)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，再結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測(cè)樣本在此時(shí)間點(diǎn)的熒光值可得其RNase污染的估值，也可通過實(shí)時(shí)熒光曲線趨勢(shì)判斷待測(cè)樣本中RNase的污染情況。

圖1 RNase活性檢測(cè)試劑盒動(dòng)力曲線

d. 示例：已知待測(cè)樣本的RFU60≥2RFU0，選擇2 min時(shí)標(biāo)準(zhǔn)品各稀釋梯度對(duì)應(yīng)的RFU制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（如下圖），將待測(cè)樣本2 min時(shí)的RFU值代入標(biāo)曲公式，即得待測(cè)樣本整體的RNase活性濃度。

圖表2 2min時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

   【注】：

1. 該試劑盒測(cè)定的是待測(cè)樣本體系整體的RNase活性殘留。

2. 試劑盒利用RNase對(duì)底物特異性切割的特性進(jìn)行檢測(cè)，因此具有使蛋白質(zhì)變性及含有使RNA單鏈斷裂的物質(zhì)不適用此試劑盒。

3. 深色液體會(huì)對(duì)熒光收集產(chǎn)生影響，可能會(huì)影響結(jié)果準(zhǔn)確性。

4. 部分待測(cè)樣本由于過酸、過堿或鹽離子濃度過高抑制RNase的活性，可視情況對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行稀釋后檢測(cè)。

5. 在使用定量方法檢測(cè)時(shí)，儀器有時(shí)初始熒光值會(huì)虛高，請(qǐng)觀察時(shí)間曲線選擇熒光值作為RFU0進(jìn)行污染判斷。