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產品簡介
| 供貨周期 | 現貨 | 貨號 | 10187ES70 |
|---|---|---|---|
| 應用領域 | 生物產業 |
產品介紹
Plant Tissue Direct PCR Kit (With Dye)
植物組織直接pcr試劑盒
產品信息
產品名稱 | 產品編號 | 規格 | 價格（元） |
Plant Tissue Direct PCR Kit (With Dye) | 10187ES50 | 50 T | 393.00 |
Plant Tissue Direct PCR Kit (With Dye) | 10187ES70 | 200 T | 1353.00 |
產品描述
植物組織直接pcr試劑盒是一款可直接對不同類型植物葉片和種子進行PCR擴增的試劑盒，適應性廣、穩定性強。試劑盒采用*的裂解緩沖液體系，可以快速的裂解多種植物樣品并釋放出基因組DNA，不需要除去蛋白、RNA或次生代謝產物等，即可將釋放出的基因組DNA作為模板直接用于PCR反應。此外，樣品使用量少，低至1 mm植物葉片或種子即可進行實驗。
本試劑盒中提供的2× Plant Master Mix具有很強的擴增兼容性，能直接以待測樣品裂解液為模板，進行高效特異性擴增。該試劑為2倍濃縮PCR反應混合液，包含了用于PCR擴增除模板和引物外的所有組分，大大簡化操作過程，降低污染幾率。
該試劑盒可用于轉基因植株鑒定、植物基因分型等。
產品組分
類別 | 編號 | 組分 | 產品編號/規格 | 儲存 | |
10187ES50（50 T） | 10187ES70（200 T） | ||||
Part I | 10187-A | Buffer P1 | 1.25 mL × 2 | 5 mL × 2 | 4℃ |
10187-B | Buffer P2 | 500 μL | 1 mL × 2 | 4℃ | |
Part II | 10187-C | 2× Plant Master Mixa | 500 μL | 1 mL × 2 | -20℃ |
a）2× Plant Master Mix：包含熱啟動Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、MgCl2、反應緩沖液、PCR反應增強劑、優化劑以及穩定劑等，同時包含電泳Loading Buffer, PCR完成之后可直接電泳。
運輸方法
冰袋運輸。
保存方法
1. 試劑10187-A【Buffer P1】，置于4℃保存。
2. 試劑10187-B【Buffer P2】，中和裂解產物，利于更長時間保存樣本，置于4℃保存。
3. 試劑10187-C【2 × Plant Master Mix】，-20℃保存，避免反復凍融。
操作方法
植物葉片
研磨裂解法：
①研磨儀破碎：將直徑5 mm左右的葉片置于50 μL Buffer P1中，用研磨儀加鋼珠（鋼珠直徑3mm左右，共2個）破碎葉片（45 Hz，1 min），葉片破碎后溶液呈現綠色，瞬時離心，上清液請放在4℃備用，取1 μL用于PCR擴增。
②槍頭搗碎：推薦使用幼嫩葉片。將直徑5 mm左右的葉片置于50 μL Buffer P1中，用槍頭將葉片搗碎，搗碎后溶液呈現綠色，瞬時離心，上清液請放在4℃備用，取1 μL用于PCR擴增。
加熱裂解法：推薦使用幼嫩葉片。將直徑5 mm左右的葉片置于50 μL Buffer P1中，95℃加熱5-10 min（確保裂解液*浸沒葉片），較難裂解的葉片（老葉片）可適當延長時間（10-20 min），加熱裂解后溶液呈現綠色，震蕩混勻，瞬時離心，上清液請放在4℃備用，取1 μL用于PCR擴增。
直接法：推薦使用幼嫩葉片。使用打孔器或者刀，將直徑1 mm左右的葉片直接加入到PCR反應體系中；復雜樣本或者是長片段的擴增，推薦使用直徑<1mm的葉片。
植物種子
加熱裂解法：用刀或者堅硬的物體取直徑約1 mm左右的種子，將其置于50 μL Buffer P1 中95℃加熱5-10 min，較難裂解的種子可適當延長時間（10-20 min），加熱后震蕩混勻，瞬時離心，底部呈現透明的糊狀，上清液請放在4℃備用，取1 μL上清液用于PCR擴增。
直接法：用刀或者堅硬的物體取直徑約1 mm左右的種子，將其置于50 μL Buffer P1（Buffer P1需要提前室溫下平衡20 min）中，用槍頭或者其他的方式搗碎種子，種子搗碎后溶液呈現乳白色，室溫靜置15 min，震蕩混勻，瞬時離心，上清液請放在4℃備用，取1 μL上清液用于PCR擴增。
PCR反應體系
組分 | 體積（μL） | 體積（μL） | 終濃度 |
2× Plant Master Mix | 10 | 25 | 1× |
Forward Primer (10 μM) | 0.5 | 1 | 0.2-0.25 μM |
Reverse Primer (10 μM) | 0.5 | 1 | 0.2-0.25 μM |
裂解產物（DNA模板） | 1 | 2 | - |
ddH2O | To 20 | To 50 | - |
【注】：各組分使用前應充分混勻。
a）模板加入量：小于PCR反應體系的5%，過多會嚴重抑制PCR反應，強烈推薦加入1 μL模板。葉片直擴優先推薦研磨儀裂解法，種子直擴優先推薦加熱法。
b）引物終濃度：0.2-0.25 μM可以得到較好結果。反應性能較差時，可在0.1-0.5 μM范圍內調整引物濃度。
c）反應體系：推薦使用20 μL或50 μL，以保證目的基因擴增的有效性和重復性。
d）體系配制：配制好PCR反應體系，置于渦旋儀上渦旋混勻，瞬時離心將反應液集于管底。
e）對照反應：建議進行PCR時，設置陽性和陰性PCR對照反應以便于排除假陽性或假陰性的干擾。
f）為了更穩定的保存裂解后的模板，將轉移出來的上清液，按照裂解產物（DNA模板）：Buffer P2 = 5:1的比例混合，混勻后-20℃保存，穩定保存隨時間和樣本狀態不同而有所不同。如果處理后的植物葉片或種子上清液一周內用于PCR擴增，不用加Buffer P2，上清液請保存在-20℃。
PCR反應條件
循環步驟 | 溫度 | 時間 | 循環數 |
預變性 | 94℃ | 5 min | 1 |
變性 | 94℃ | 10 sec | 35 |
退火 | 50-65℃ | 20 sec | |
延伸 | 72℃ | 1 min | |
終延伸 | 72℃ | 5 min | 1 |
【注】：a）退火溫度：請參考引物的理論 Tm 值，退火溫度可設置低于引物理論值 2-5℃。
b）延伸時間：需要根據片段的長度來確定，對于1 kb以內的DNA///片段，建議延長時間為1 min。
注意事項
1. 做葉片實驗時，建議使用新鮮采取的葉片組織，若為長期冷凍組織，需-80℃保存，應盡量避免反復凍融，以免造成模板降解，影響PCR效率。葉片組織以幼嫩為宜，若為成熟的葉片，避免使用葉片主脈部位組織；做種子實驗時，不要用發霉的種子，發霉的種子很可能導致試驗失敗。
2. 建議擴增片段長度1 kb以內，以便擴增效率///佳。
3. 取樣時使用打孔器或者刀取適宜大小的樣本，樣本不同時，打孔器或者刀每次處理樣本前需清洗干凈。
4. 對于葉片組織，建議取1-10 mm的葉片，過小會使PCR擴增產量低，過多會抑制PCR反應，采用加熱裂解法、槍頭搗碎、研磨儀破碎的方式處理植物葉片，處理后需震蕩離心，務必取上清液試驗，沉淀會嚴重抑制PCR反應；對于種子組織，取1-3 mm的種子，過小會使PCR擴增產量低，過多會嚴重抑制PCR反應，采用加熱裂解法裂解種子，處理后震蕩離心，務必取上清液試驗，沉淀會嚴重抑制PCR反應。
5.為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。
常見問題與解決方法
常見問題 | 可能原因 | 解決方法 |
陽性對照、待測樣本均無條帶。 | PCR反應體系或反應條件不合適。 | 使用梯度PCR摸索PCR///佳反應條件。 |
PCR試劑保存不當失去活性。 | 2× PCR Mix應保存于-20℃，使用時避免反復凍融。若使用頻繁，可在4℃短時間存放。 | |
引物設計問題。 | 嘗試重新設計引物進行檢查。 | |
陽性對照有目的條帶，待測樣本無條帶或條帶弱。 | 裂解液、中和液加入比例不當，裂解混合液影響PCR體系的pH值。 | 正常條件下，中和后的裂解混合液的 pH 應該在7-8左右(裂解產物和Buffer P2嚴格按照5:1的量進行中和)。 |
樣本裂解混合液保存不當或保存時間過久，DNA基因組已經降解。 | 裂解混合液液可在4℃保存5天，盡量使用新制備的裂解液混合液進行PCR。 | |
模板加入量不適合。 | 在反應體系<5%范圍內優化模板加入量。 | |
PCR循環數不足。 | 適當增加PCR的循環數，推薦35-40循環為佳。因模板復雜，一般PCR反應要比用純化的DNA模板多5-10個循環為佳。 | |
非特異性擴增 | PCR退火溫度太低，循環數、引物濃度或模板濃度太高。 | 增加PCR退火溫度，降低PCR循環數、引物濃度或模板濃度。 |
PCR引物錯配。 | 重新設計PCR引物。 | |
配制PCR反應體系時溫度太高或配制完成后放置時間太久。 | PCR反應體系的配制在低溫下進行，配制完成后盡快進行PCR擴增反應。 | |
陰性對照出現目的條帶 | 操作工具或試劑污染。 | 實驗所有試劑或器材均應高壓滅菌。操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。 |
樣本間交叉污染。 | 每個取樣器只對一個樣本使用；或取完一個樣本后，將取樣器刃口浸入2%的次氯酸鈉溶液中，反復涮洗，然后用干凈的紙巾擦干殘液。 |
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