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翌圣生物科技（上海）股份有限公司
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產品簡介
| 供貨周期 | 現貨 | 貨號 | 40752ES |
|---|---|---|---|
| 應用領域 | 醫療衛生,生物產業,制藥/生物制藥,綜合 |
產品介紹
產品描述
JC-10線粒體膜電位熒光探針試劑盒是JC-1的升級產品，同樣可用于檢測線粒體膜電位的變化。因JC-1雖然在許多實驗中被廣泛應用，但是其水溶性很差，即使在1 μM濃度的條件下，JC-1也會在水的緩沖液中析出。而JC-10具有更好的水溶性，可以在某些需要高濃度染料的實驗中替代JC-1。雖然在一些細胞系中JC-10有著比JC-1更好的表現，不過，JC-10的性能表現具細胞依賴性特征。
正常細胞內，JC-10選擇性聚集在線粒體基質中形成可逆的紅色熒光聚合物（Ex=540 nm, Em=590 nm）；不健康的線粒體由于膜電位的下降或喪失，JC-10由多聚體轉變為單體形式存在于胞漿中，產生綠色熒光（Ex=490 nm, Em=525 nm）。JC-10不僅可用于定性檢測，因顏色的變化可以非常直接的反映出線粒體膜電位的變化。也可以用于定量檢測，因線粒體的去極化程度可以通過紅/綠熒光強度的比例來衡量。這兩種顏色的變化可以用流式細胞儀上的標準濾光器檢測到，綠色熒光可用FL1通道分析，紅色熒光可用FL2通道分析。除了用于流式細胞術，也可以用于熒光成像和熒光酶標板檢測平臺。
本試劑盒中提供了陽性對照CCCP，其能誘導線粒體膜電位下降。對于六孔板中的樣品，本試劑盒共可以檢測100個樣品。
產品組分
編號 | 組分 | 規格 |
40752-A | JC-10（200×） | 100 μL×5 |
40752-B | CCCP（10 mM） | 20 μL |
40752-C | JC-10染色緩沖液（5×） | 80 mL |
40752-D | 超純水 | 90 mL |
運輸與保存方法
冰袋（wet ice）運輸。-20℃干燥避光保存，分裝，以避免反復凍融，一年有效。超純水和JC-10染色緩沖液（5×）也可4℃保存。
注意事項
1）JC-10（200×）在4℃、冰浴等較低溫度情況下會凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內，可以20～25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用。
2）須把JC-10（200×）用試劑盒提供的超純水充分溶解混勻后才可加入JC-10染色緩沖液（5×）。不可先配制JC-10染色緩沖液（1×）再加入JC-10（200×），否則JC-10將很難充分溶解并會嚴重影響后續的檢測使用。
3）使JC-10染色緩沖液（1×）保持4℃左右，此時的洗滌效果較好。
4）JC-10探針裝載完并洗滌后盡量在30分鐘內完成后續檢測過程。在檢測前需冰浴保存。
5）請勿把JC-10染色緩沖液（5×）全部配制成JC-10染色緩沖液（1×），本試劑盒使用過程中需直接使用JC-10染色緩沖液（5×）。
6）如果發現JC-10染色緩沖液（5×）中有沉淀，必須全部溶解后才能使用，為促進溶解可以在37℃加熱。
7）CCCP為線粒體電子傳遞鏈抑制劑，有毒，請注意小心防護。
8）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
9）本產品僅作科研用途！
使用方法
1. JC-10染色工作液的配置
取適量JC-10（200×），按照每50 μL JC-10（200×）加入8 mL超純水的比例稀釋，劇烈震蕩充分溶解并混勻JC-10，然后再加入2 mL JC-10染色緩沖液（5×），混勻后即為JC-10染色工作液。
2. 陽性對照的設置
取出試劑盒中供的CCCP（10 mM）按照1∶1000的比例加入到細胞培養液中，使其終濃度為10 μM，處理細胞20分鐘。隨后按照下述方法裝載JC-10，進行線粒體膜電位的檢測。對于大多數細胞，通常10 μM CCCP處理20分鐘后線粒體的膜電位會喪失，JC-10染色后觀察應呈綠色熒光；而正常的細胞經JC-10染色后應顯示紅色熒光。對于特定的細胞，CCCP的作用濃度和作用時間可能有所不同，需自行參考相關文獻資料決定。
3. 細胞染色
3.1對于懸浮細胞
1）取1×105～6×105個細胞重懸于0.5 mL細胞培養液中（可以含血清和酚紅），加入0.5 mL JC-10染色工作液，顛倒混勻。
2）37℃孵育20分鐘。孵育期間，按每1 mL JC-10染色緩沖液（5×）加入4 mL蒸餾水的比例配制適量的JC-10染色緩沖液（1×），并置于冰浴，作為洗液。
3）37℃孵育結束后，600g 4℃離心3～4分鐘，棄上清，注意盡量不要吸除細胞。加入1 mL JC-10染色緩沖液（1×）重懸細胞，600 g， 4℃離心3～4分鐘，棄上清，重復一次。
4）用適量JC-10染色緩沖液（1×）重懸后，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可以用熒光分光光度計檢測或流式細胞儀分析。
3.2對于貼壁細胞
1）對于6孔板，吸除培養液，根據具體實驗如有必要可用PBS或其它適當溶液洗滌細胞一次，加入1 mL細胞培養液（可
以含血清和酚紅）。
2）然后加入1 mL JC-10染色工作液，充分混勻。細胞培養箱中37℃孵育20分鐘。孵育期間，按每1 mL JC-10染色緩沖液（5×）加入4 mL蒸餾水的比例配制適量的JC-10染色緩沖液（1×），并放置于冰浴，作為洗液。
3）37℃孵育結束后，吸除上清，用JC-10染色緩沖液（1×）洗滌2次。
4）加入2 mL細胞培養液，培養液中可以含有血清和酚紅。在熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察。
注：對于貼壁細胞，如果希望采用熒光分光光度計或流式細胞儀檢測，可以先收集細胞，重懸后參考懸浮細胞的檢測方法。
3.3對于純化的線粒體
1）把配制好的JC-10染色工作液用JC-10染色緩沖液（1×）稀釋5倍。取5倍稀釋的JC-10染色工作液0.9 mL 加入0.1 mL總蛋白量為10～100 μg純化的線粒體。
2）用熒光分光光度計或熒光酶標儀檢測：混勻后直接用熒光分光光度計進行時間掃描（time scan），激發波長為485 nm，發射波長為590 nm。如果使用熒光酶標儀，激發波長不能設置為485nm時，可以在475～520nm范圍內設置激發波長。
4. 熒光觀測
檢測JC-10單體時可以把激發光設置為490 nm，發射光設置為530 nm；檢測JC-10聚合物時，可以把激發光設置為525 nm，發射光設置為590 nm。
注：此處測定熒光時不必把激發光和發射光設置在最大激發波長和最大發射波長。如使用熒光顯微鏡觀察，檢測JC-10單體時可以參考觀察其它綠色熒光時的設置，如觀察GFP或FITC時的設置；檢測JC-10聚合物時可以參考觀察其它紅色熒光，如碘化丙啶或Cy3時的設置。
