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探秘細胞凋亡
--細胞凋亡檢測工具大盤點
細胞凋亡是一個神秘的過程，在機體內時刻進行著……
何為細胞凋亡
細胞凋亡（Apoptosis）一般是指機體細胞在發育過程中或在某些因素作用下通過細胞內基因及其產物的調控而發生的一種程序性細胞死亡過程。 細胞凋亡途徑中各事件的發生是有時序性的，即各事件按先后順序依次發生，zui終導致凋亡小體的出現，細胞隨后發生凋亡。細胞凋亡對胚胎發育及形態發生（morphogenesis）、組織內正常細胞群的穩定、機體的防御和免疫反應、疾病或中毒時引起的細胞損傷、老化、腫瘤的發生進展起著重要作用，并具有潛在的治療意義。
圖1：細胞凋亡過程
細胞凋亡的三個典型特征：
細胞處于不同的凋亡階段具有不同的生物學特征，典型的特征包括：1）細胞膜PS（磷脂酰絲氨酸）外翻；2）線粒體膜電位喪失；3）細胞核濃縮和斷裂
想要探秘凋亡處于哪個階段，小編為您支三招。
工具1 ——凋亡早期檢測
在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸（Phosphotidylserine, PS）位于細胞膜內側，但在早期凋亡的細胞中，PS由細胞膜的內側翻轉到細胞膜表面，暴露在細胞外環境中。Annexin-Ⅴ（膜聯蛋白-V）是一種分子量為35-36 kDa的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力結合，通過細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。
檢測方法：用熒光素（FITC、Alexa Fluor488等）標記的 Annexin-V 作為探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生。另外，碘化丙啶（propidine iodide, PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI 能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此將 Annexin-V 與 PI 匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開來。 |
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工具2——凋亡中期檢測
線粒體膜電位（△Ψm ）的丟失導致線粒體膜中線粒體通透性轉換孔的開放，細胞色素C（Cytochrome C）被釋放到細胞漿中，致使Caspase被激活從而誘導細胞凋亡。
檢測方法：JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位（△Ψm ）的理想熒光探針，表現出電勢依賴性的積聚在線粒體內。正常線粒體內，JC-1聚集在線粒體基質中形成聚合物，聚合物發出強烈的紅色熒光；而在凋亡細胞中，線粒體跨膜電位去極化，JC-1從線粒體內釋放，濃度降低，逆轉為發射綠色熒光的單體形式。因此顏色的變化將直接反映出線粒體膜電位的變化。線粒體的去極化程度也可以通過紅/綠熒光強度的比例來衡量。JC-1的流式檢測是比較常見的一種方法。
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工具3——凋亡晚期檢測
細胞凋亡晚期，染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產生大量的粘性3’-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下，將熒光素/酶標記的dUTP結合到DNA的3’--OH末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL）
細胞凋亡檢測三把斧，您get到了嗎？
附上小編一些檢測實驗TIPS
AnnexinV/PI檢測
Q：Annexin V/ PI 試劑盒能否檢測除人以外其他動物細胞凋亡情況？
A：可以。因為Annexin V 是與磷脂酰絲氨酸（PS）的結合，而PS不存在種屬間差異。
Q：使用Annexin V/ PI 試劑盒進行凋亡檢測，用含EDTA 的胰酶消化細胞對結果有影響嗎？
A：會。因為Annexin V 是Ca2+ 依賴的蛋白，EDTA會 螯合Ca2+從而影響Annexin V與PS 的結合，進而影響實驗結果。
Q：如果細胞自帶GFP蛋白，請問哪種凋亡檢測試劑盒適用該細胞的凋亡檢測？
A：選用PE標記或者APC標記的Annexin V凋亡檢測試劑。
Q：對于來自血液的細胞樣品，為什么去除血液中的血小板？
A：因為血小板中含有PS，其能與Annexin V結合進而干擾實驗結果。
Q：Annexin -V 在實驗操作上應注意哪些事項？
A：由于Annexin -V染料上帶有熒光基團，在實驗操作上應盡量避光操作和孵育；為保證實驗結果的正確性應在染色后1h內上機檢測。
TUNEL檢測
Q：組織切片厚度多少比較合適？
A：組織切片過厚，會使得固定效果不理想，控制在10 μm以內。
Q：除了多聚甲醛固定，可不可以使用甲醇固定？
A：使用乙醇或甲醇固定會導致標記的效率較低。酸性固定液，也容易導致假陽性的出現。建議采用新鮮配置的4%中性多聚甲醛固定液。
Q：如何避免出現非特異性熒光標記？
A：（1）對于本身核酶或聚合酶活性水平較高的組織/細胞，例如平滑肌細胞，建議取細胞或組織后立即固定并且要充分固定，以阻止這些酶導致假陽性。
（2）在進行末端標記的時候，保證細胞或組織表面保持濕潤，檢測反應液能很好地覆蓋樣品。
Q：Tunel檢測在實驗操作上有哪些注意事項？
A：熒光基團長期暴露在普通光照下，會發生嚴重淬滅，因此在實驗操作上應盡量避光操作和孵育。
熒光補償的調節：
Q：光補償調節的原則？
A: 1）用于調節補償的樣本必須單染。
2）用來調節補償的熒光素必須與實驗用的熒光素一樣（例如不能用FITC調節EGFP的補償）。
2）橫平豎直：理論上X-Mean或者Y-Mean要相等（如圖所示），但在實際操作中，只需要保證單染的細胞不跨區存在。
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Q：如何進行光補償的調節？
A：進行熒光補償的調節，需要設置幾組對照實驗。以AnnxinV-FITC/PI雙染試劑盒為例；
1）空白對照組：不進行任何標記的細胞，用于電壓的調節，調整前向散射和側向散射，得到清晰劃分的細胞群體。
2）凋亡誘導的單染組：陽性對照的細胞群體需要超過分析的細胞群體的10%，用于調節補償。
3）雙染實驗組：利用空白對照組和單染組調節好的參數進行實驗數據的獲得。
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