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分子克隆知多少
*個人造生命細胞——Mycoplasma mycoides
2010年，借助于已知的基因組序列信息，偉大的JCVI研究所（J. Craig Venter Institute）的偉大的合成生物學博士Daniel Gibson及其同事精心設計、合成并巧妙組裝出完整的Mycoplasma mycoides基因組（大小為1.08Mbp），并將之轉移到不含任何基因組的受體細胞（Mycoplasma capricolum）中，進而人造出*個生命細胞——Mycoplasma mycoides細胞。令人驚奇的是，新的生命細胞表現出預期的表型特征，且具備自主復制的能力。需要特別提出的是：用于片段組裝的分子克隆技術及酵母同源重組技術功不可沒。
（圖1.The assembly of a synthetic M. mycoides genome in yeast. DOI: 10.1126/science.1190719）
與PCR、qPCR等技術一樣，作為分子實驗室*手段，分子克隆技術被廣泛用于多樣的基因功能研究。所謂分子克隆指的是在體外將核酸分子插入病毒、質粒或其他載體分子，構成遺傳物質的新組合，使之進入宿主細胞內并獲得持續穩定增殖能力和表達（現代分子生物學，第3版）。
分子克隆方法大全
分子克隆技術的發展經歷3個階段，*階段為經典的T4 DNA連接酶介導的TA克隆及粘性末端克隆，第二階段為基于DNA修飾酶的LIC系列克隆，第三階段為基于DNA重組酶的Gateway克隆及一步法克隆（該方法與Daniel Gibson等所發明的技術原理相同，原理詳見后面部分）。
分子克隆技術發展歷程
常見的分子克隆類型
1.基于T4 DNA連接酶的克隆
本系列克隆使用的酶類為：T4 DNA連接酶（和限制性內切酶）。
T4 DNA連接酶作用：可以催化目的片段和載體zui后一位堿基上的5’磷酸基團和3’羥基形成磷酸二酯鍵，以實現將目的片段和載體連接成環狀質粒。
限制性內切酶作用：可以對目的片段和載體識別并切割出相同的粘性末端，用于堿基互補配對。
根據是否使用限制性內切酶，可分為平末端克隆/TA克隆和粘性末端克隆。
1.1平末端克隆/TA克隆
該方法可用于目的基因的測序或保存，或用于文庫構建等。其克隆原理和過程如圖所示。
1.2粘性末端克隆
zui為傳統、zui為經典的克隆方法，現在依舊被眾多實驗室廣泛使用。該克隆方法可用于構建表達載體、轉染質粒等。
2.基于DNA修飾酶的克隆方法
今天所介紹的該系列克隆方法依賴的酶為：T4 DNA聚合酶。
T4 DNA聚合酶的作用：具有3'→5'核酸外切酶活性和5'→3' DNA聚合酶活性。缺乏dNTP時，表現為3'→5'核酸外切酶活性，切割目的基因和載體，產生單鏈的DNA粘性末端；加入某一單獨dNTP，3'→5'核酸外切酶活性和5'→3' DNA聚合酶活性平衡，摻入與切割動態平衡，切割終止。
因此，T4 DNA聚合酶為基礎的克隆方法的關鍵是目的基因和載體間需要有一定數量的重疊序列。
2.1 LIC克隆法
通過T4 DNA聚合酶的3'→5'核酸外切活性分別處理目的基因和載體的PCR產物，產生12nt的5'突出互補末端，利用突出的互補末端之間的退火進行基因克隆。12nt為人為額外添加。
克隆過程：
1、用5'端帶有重疊序列的特異性引物分別擴增目的DNA基因和載體，獲得帶有重疊序列的目的基因和線性化質粒；
2、使用T4 DNA聚合酶的3'→5'核酸外切酶活性分別消化PCR擴增得到的目的基因和載體；
3、產生粘性末端后，添加某一成分dNTP，終止切割；
4、將帶有重疊序列的兩個片段進行退火，就形成了帶有切口的環狀質粒；
5、轉化后，大腸桿菌內的修復機制修復損傷的DNA分子，經過復制得到大量目的質粒。
2.2 SLIC克隆法
與LIC克隆不同，SLIC克隆中目的基因和載體的重疊序列使用的是載體末端序列，因此SLIC克隆為無縫克隆。
克隆過程：
1、用帶有重疊序列的特異性引物擴增目的基因，用限制性內切酶或PCR擴增得到線性化質粒；
2、T4 DNA聚合酶分別處理PCR擴增得到的目的基因和線性化質粒一段時間；
3、產生粘性末端后，添加某一單獨dNTP終止反應，從而得到含有一段粘性末端的目的基因和線性化質粒；
4、然后目的基因和線性化質粒經過變性、退火，得到帶有“缺口”的環狀質粒；
5、轉化后，經過大腸桿菌體內修復機制，獲得完整環狀質粒。
3.基于重組酶的克隆方法
今天介紹的該系列克隆方法雖同為重組法克隆，但酶的性質不同，故分開論述。
3.1 Gateway克隆法——實現基因在不同類型載體間“穿梭”
該技術依賴的酶：λ整合酶Int、λ切除酶Xis、大腸桿菌IHF因子。
該技術需要四個特異性重組位點（attB、aatP、attL、attR），引導發生兩個特異性重組反應（BP反應和LR反應）。
BP反應：將目的基因克隆進入入門質粒。使用到的酶為Int和IHF。
LR反應：將入門質粒中的目的基因轉移到終載體中，獲得表達載體。使用到的酶為Int、IHF及Xis。
終載體若帶有attR位點，則帶有attL位點的入門克隆便可以與之發生LR反應，進而將入門克隆的目的基因轉移到不同類型的終載體中。
3.2 一步法克隆——Daniel Gibson發明的分子克隆方法的“簡版”
該技術依賴的“重組酶”：核酸外切酶、高保真DNA聚合酶及連接酶。
該技術的基礎同樣為：目的基因和載體之間需要15-20bp的重疊序列。
前文提到的LIC、SLIC等方法都要“粘性”末端暴露、添加dNTP終止和“粘性”末端退火等過程，操作繁瑣。而一步法克隆能夠在一個反應體系中實現“粘性”末端暴露、退火及片段的組裝。
3.5 TOPO克隆——zui快速、的克隆
Topo克隆技術依賴的酶為：兼具內切酶活性與連接酶活性的拓撲異構酶Ⅰ。
拓撲異構酶Ⅰ的作用：識別特定序列位點（CCCTT），并在2min內對位點處完成80%的酶切連接反應。
因此，Topo克隆反應僅需2-5min完成。Topo克隆技術是潛力的克隆技術。
4.其他克隆方法
不同克隆方法的聯合使用，可實現快速的克隆。如使用一步法克隆將目的基因克隆進入入門載體后，與Gateway克隆結合可實現目的基因在不同終載體中的穿梭。同理，使用Topo克隆與Gateway克隆聯合亦可達到相同目的。
選擇*的克隆方法
特征 | Topo 克隆 | 一步法 克隆 | Gateway克隆 | SLIC 克隆 | 粘性末端克隆 | TA克隆 |
關鍵酶
| 拓撲異構酶Ⅰ
| 核酸外切酶 DNA聚合酶 DNA連接酶 | λ整合酶Int λ切除酶Xis IHF因子 | T4 DNA聚合酶
| T4 DNA連接酶 限制性內切酶 | T4 DNA連接酶
|
反應時間 | 2-5min | 20-50min | 70min×2 | 30min+30min | 15min/12-16h | 15min/12-16h |
實驗步驟 | 4 | 4 | 7 | 5 | 6 | 4 |
插入片段大小 | 5kb | ＞5kb | 100bp-11kb | ＞5kb | 受載體限制 | 較小片段 |
一次性插入片段個數 | 1 | 1-5 | 1-4 | 1-10 | 1 | 1 |
克隆效率 | 100% | ＞95% | ＞95% | - | 50% | 60-80% |
重組載體大小 | ≤8kb | ≤16kb | - | ≤19kb | - | ＜6kb |
局限性
| 1、載體固定，構建表達載體需亞克隆
| 1、引物較長
| 1、價格昂貴 2、需要帶有特異性att位點的載體 3、引物較長
| 1、引物較長 2、步驟較一步法克隆復雜
| 1、受酶切位點的限制 2、受T4 DNA連接酶的限制 3、假陽性高 4、無法進行多片段克隆 5、步驟繁瑣 6、費時 | 1、受T4 DNA連接酶的限制 2、假陽性高 3、進行基因功能研究時，需要亞克隆
|
主要優勢
| 1、快速、簡便、室溫操作 2、克隆效率高 3、用于A尾PCR產物/平末端PCR產物克隆 4、自帶載體 5、價格便宜
| 1、快速、簡便 2、克隆效率高 3、不受酶切位點限制 4、一步多片段克隆、點突變克隆 5、適用于任意載體任意片段 6、價格便宜 | 1、反應迅速 2、克隆效率高 3、不受酶切位點限制 4、可實現基因在不同載體間穿梭 5、自帶載體
| 1、不受酶切位點限制 2、適用于任意載體任意片段 3、可進行多片段克隆
| 1、方法建立zui久 2、可分步進行，便于檢查問題
| 1、簡便
|
HB170904
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