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北大湯富酬團隊：發表單細胞表觀多組學測序技術（single-cell COOL-seq）成果
一個細胞完成5個組學層面的測定，這種方法你知道嗎？
現有的基于高通量測序來分析全基因組染色質狀態的研究方法通常需要大量細胞，并且難以在單細胞分辨率上對多種組學之間的互動關系進行研究。2017年6月16日，北京大學生命科學學院生物動態光學成像中心湯富酬課題組在上發展了對一個單細胞同時進行染色質狀態、DNA甲基化、基因組拷貝數變異、以及染色體倍性的全基因組測序技術（single-cell COOL-seq），并采用這一技術在單細胞分辨率上系統、深入地解析了小鼠著床前胚胎發育過程中表觀基因組重編程的關鍵特征，以及染色質狀態與DNA甲基化之間的互動關系，并在《Cell Research》雜志上在線發表了題為“Single-cell multi-omics sequencing of mouse early embryos and embryonic stem cells”的研究論文。
論文解讀：
現有的基于高通量測序來分析全基因組染色質狀態的研究方法通常需要大量細胞（例如ATAC-seq、DNase-seq、FAIRE-seq、MNase-seq等）。即使這些方法可以做到單細胞分辨率，也無法對同一個單細胞的各個表觀基因組層面同時進行分析，因而無法在單細胞分辨率上對多種組學之間的互動關系進行研究。
湯富酬課題組將NOMe-seq（全基因組核小體定位及DNA甲基化組測序）技術和PBAT-seq技術（全基因組重亞硫酸鹽測序）巧妙地結合起來（圖1），并進行了系統的優化和提高，實現了對同一個單細胞進行多達5個層面（染色質狀態、核小體定位、DNA甲基化、基因組拷貝數變異和染色體倍性）的基因組和表觀基因組特征的分析。
圖1: single-cell COOL-seq原理圖
技術優點：
scCOOL-seq技術除了可以在單細胞水平上同時對多種組學進行分析，與現有的分析染色質狀態的單細胞測序技術相比，scCOOL-seq技術還具有如下優點：
（1）對于基因組中核心的功能元件區域具有很高的靈敏度和覆蓋度。例如，對于小鼠胚胎干細胞系的一個單細胞，可以同時檢測到18,000多個基因（所有已知基因的75%）的啟動子區域的染色質狀態以及DNA甲基化水平, 也可以同時檢測到11,000多個CpG島（所有已知CpG島的70%）的染色質狀態以及DNA甲基化水平；這為分析干細胞分化發育過程中染色質狀態的異質性以及DNA甲基化水平的異質性提供了強大的工具。
（2）可以地鑒定出染色質的開放狀態和關閉狀態，準確地把染色質關閉狀態與由于技術原因未檢測到的情況（假陰性）區分開來。現有的其他單細胞染色質狀態測序技術（例如scATAC-seq和scDNase-seq技術）無法將染色質關閉狀態和未檢測到的情況（假陰性）區分開，這一缺點在現有技術的靈敏度比較低的情況下尤為嚴重。而scCOOL-seq技術可以準確地區分染色質關閉狀態（檢測到了該基因組DNA片段，但是其中的GpC位點沒有被甲基化）和由于技術原因未檢測到的情況（沒有檢測到該基因組DNA片段）。這樣對一種細胞類型中不同的單個細胞之間同一個基因組區域的染色質開放狀態和關閉狀態之間的比例可以給出的測量結果，而不受檢測靈敏度波動的影響。
（3）可以對同一個DNA單分子同時獲得其染色質狀態和DNA甲基化的信息，使得這一技術不但具有單細胞分辨率，甚至達到了單分子分辨率，可以對同一個二倍體細胞的兩個等位基因分別進行染色質狀態和DNA甲基化的分析。
（4）由于該方法同時擴增和測序開放的和關閉的染色質區域，因而不受細胞中線粒體DNA含量波動的影響。在細胞中線粒體DNA通常是環形裸露的DNA，一般處于開放狀態。現有的其他單細胞染色質狀態測序技術（例如scATAC-seq和scDNase-seq技術）由于只擴增和測序開放的染色質區域，因而極大地受細胞中線粒體DNA含量的影響，特別是在著床前的早期胚胎細胞中線粒體DNA的含量是普通細胞的數十倍甚至數百倍，因而對于scATAC-seq和scDNase-seq等技術造成嚴重影響。而scCOOL-seq技術由于同時擴增和測序開放的和關閉的染色質區域而不受這一問題的影響。
（5）由于摻入了10% - 20%的外源lambda DNA，所以可以準確判斷所分析單個細胞所處的細胞周期階段以及染色體倍性。這對于準確分析染色質狀態和DNA甲基化與細胞周期以及染色體倍性的關系非常有幫助。
考慮到多組學的信息量、有效數據量帶來的高昂測序成本等問題，對于細胞數量少，異質性強的著床前胚胎發育過程的研究，scCOOL-seq方法非常適合。該方法可以更好地覆蓋全基因組，有效地解決了目前scATAC-seq研究中線粒體片段過度富集導致的有效數據量過少的問題。同時，該方法可以同時分析單個細胞中染色質開放程度、核小體定位、DNA甲基化、基因組拷貝數變異、以及染色體倍性這5個組學層面，對于難以大量獲得的哺乳動物早期胚胎的發育、以及復雜的癌癥等疾病研究，都將提供全面有效的解決方案。
湯富酬課題組選擇使用翊圣超靈敏PCR法支原體檢測試劑（Yeasen，CAT#40601，GMyc-PCR Mycoplasma Test Kit）檢測樣本中是否含有支原體污染，以此保證樣本的純凈度，讓測序獲得更多有價值的信息。 以下截圖來自文章：
翊圣生物含有全線支原體系列產品，做到檢測、預防、去除“一步到位”。 下圖展示的是使用翊圣PCR法支原體檢測試劑擴增含不同濃度支原體樣品后獲得的凝膠電泳圖。
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實例應用：
該課題組利用這一新建立的scCOOL-seq方法，在單細胞分辨率系統地描繪了小鼠著床前胚胎發育過程中表觀基因組多個層面的動態變化。高度特化的精子和卵細胞結合后，會進行一系列復雜、的染色質重塑過程，從而建立起早期胚胎發育的性和多能性。對該過程的解析將有利于人們理解細胞多能性建立過程中的表觀遺傳調控機制以及胚胎發育異常的分子機理，該項研究發現：
（1）受精后12小時以內，來自高度特化的卵細胞和精子的雌雄原核就經歷了大規模的基因組去甲基化，父源基因組DNA甲基化程度從精子中的80%（平均數）降低到雄原核中的38%（p=1.4×10-11）；同時母源基因組DNA甲基化程度從卵細胞中的32%降低到雌原核中的28%（p=6.3×10-5）。在此過程中，父母源基因組的染色體狀態迅速打開，在受精卵的原核期就已經達到高度開放的狀態，隨后在受精卵晚期染色質開放程度大幅度回落，并在2-細胞階段之后開放程度再次逐步增加，到囊胚期時達到zui高點（圖2）。
圖2：小鼠著床前胚胎發育過程中基因組內源DNA甲基化（A）與染色質狀態（B）以及染色質狀態異質性（基因啟動子區域；Homogeneously open、Divergent、Homogeneously closed三種異質性狀態）（C）（D）的動態變化
（2）在單細胞分辨率系統分析了小鼠著床前胚胎發育過程中染色質狀態的異質性。根據每個基因啟動子區域在同一個發育階段不同單細胞之間染色質狀態的異質性，將小鼠的基因劃分成均勻開放（Homogeneously open）、開放/關閉混合態（Divergent）、均勻關閉（Homogeneously closed）這三種狀態。該研究發現在受精后12個小時以內受精卵中大部分基因的啟動子區域就由均勻關閉狀態迅速重編程為均勻開放狀態，為合子基因在隨后的轉錄做好準備（圖2）。
（3）通過RNA聚合酶抑制劑抑制轉錄的實驗，在單細胞分辨率證明持續轉錄對于維持基因啟動子區域的染色質開放狀態具有重要作用。從受精前的卵細胞到受精后的晚期受精卵時期，啟動子區大片段染色質開放區域（長度大于300bp）的數量大幅度增加。該研究發現，使用RNA聚合酶抑制劑α-Amanitin處理受精卵、抑制其轉錄活動，會導致數千個（56%）基因的啟動子區大片段染色質開放區域重新關閉，說明持續的轉錄對于維持早期胚胎中大部分基因的啟動子處于開放狀態是必需的，染色質狀態開放和轉錄活動互相促進，共同維持合子基因的穩定表達（圖3）。
圖3：轉錄對染色質開放狀態的維持以及轉錄因子對染色質開放區域的調控作用
（4）發現多能性核心因子Oct4的靶基因結合位點在4-細胞階段就已經打開并處于開放狀態，遠早于真正建立多能性的囊胚期，暗示這些位點作為潛在的順式調控元件可能參與了早期胚胎細胞的命運決定過程。
（5）在單個細胞內對父母源基因組的染色質狀態以及DNA甲基化進行了深入分析。從受精卵晚期到4細胞胚胎時期，在基因間區（intergenic region）父源基因組甲基化要明顯高于母源基因組；而在基因區（gene body），父源基因組甲基化要顯著低于母源基因組。這是由于在基因間區，父源基因組的去甲基化速度較慢；而在基因區，父源基因組的去甲基化速度要遠快于母源基因組的去甲基化速度。更重要的是，對于基因區，胚胎期表達水平越高的基因其父母源基因組DNA甲基化的不對稱性越強烈（表達水平越高，母源基因組甲基化就比父源基因組高越多）。與此相反，受精后父母源基因組的染色質狀態就迅速同步打開，到受精后12小時，父母源基因組的染色質狀態在每個單細胞中就已經達到相同的開放狀態，并在整個植入前時期維持這一父母源基因組之間染色質狀態的平衡。這說明受精后，染色質狀態和DNA甲基化進行了不同步的重編程過程，由于染色質狀態對于合子基因的激活可能更重要，所以受精后父母源基因組的染色質狀態快速重編程、在每個單細胞中迅速達到平衡并一直維持。而DNA甲基化的重編程要慢一些并在父母源基因組之間維持不對稱分布：在基因間區，父源基因組甲基化高于母源基因組；而在基因區，父源基因組甲基化低于母源基因組，并且與胚胎期基因表達水平相關（圖4）。
圖4：小鼠著床前胚胎發育過程中父母源基因組DNA甲基化的不對稱分布
（6）在單細胞分辨率解析了雌性胚胎細胞中父母源X染色體的DNA甲基化和染色質狀態重編程過程的異同。從配子到原核期受精卵，父源X染色體的DNA去甲基化速度明顯比常染色體慢，而母源X染色體的DNA去甲基化速度和常染色體相當。從受精卵晚期到4細胞胚胎時期，父源X染色體的DNA甲基化明顯高于母源X染色體，直到囊胚期，父母源X染色體的DNA甲基化水平才達到一致。這說明受精之后，在雌性胚胎中失活的父源X染色體其DNA甲基化重編程速度要明顯慢于活躍的母源X染色體。二者之間DNA甲基化的差異一直到囊胚晚期才逐漸消除。受精后，雌性胚胎中父母源X染色體同步進行快速的染色質狀態重編程，并在整個植入前時期維持這一父母源X染色體之間染色質狀態的平衡。（圖5）。
圖5：小鼠著床前雌性胚胎單個細胞中父母源X染色體的DNA甲基化和染色質狀態的動態變化
（7）在單細胞分辨率揭示了小鼠植入前胚胎發育過程中表觀基因組的異質性。受精后，基因組中大部分基因的啟動子區域在同一種細胞的不同單個細胞之間維持著均勻的DNA甲基化和均勻的染色質開放狀態。部分基因啟動子區域的DNA甲基化或染色質狀態在同一個階段胚胎內不同單個細胞之間具有強烈的異質性。然而，啟動子區域DNA甲基化異質性強烈的基因和染色質狀態異質性強烈的基因分別是兩類不同的基因。這暗示在小鼠著床前胚胎發育的過程中，染色質狀態異質性和DNA甲基化異質性可能分別受不同機制的調控。
（8）在單細胞分辨率將細胞周期與染色質狀態了起來。研究人員在每個單細胞文庫中加入了等量的lambda DNA，通過基因組測序讀數和lambda DNA測序讀數之間的比例準確推斷出每個單細胞的倍性和細胞周期階段。該研究利用小鼠胚胎干細胞研究中已有的染色質優先復制和后續復制區域作為參照，發現這些區域在小鼠著床前胚胎發育過程中復制先后順序和胚胎干細胞中一致，說明小鼠著床前胚胎在體內發育過程中和胚胎干細胞使用了基本相同的一組DNA復制起始位點。
圖6:小鼠著床前胚胎DNA甲基化和染色質重塑特征示意圖
該研究在上開發了對同一個單細胞可以同時研究其染色質狀態、核小體定位、DNA甲基化、基因組拷貝數變異、以及染色體倍性5個層面的單細胞多組學測序技術，并利用該技術對小鼠著床前胚胎發育的7個關鍵階段進行了全基因組水平、單細胞分辨率、單堿基精度的表觀基因組研究，并深度解析了父母源基因組在著床前胚胎發育中DNA甲基化和染色質狀態的重編程過程。該研究系統地描繪了高度特化的配子在受精后重編程到具有發育性的受精卵、以及進一步發育成多能性胚胎的過程中， DNA甲基化和染色質狀態發生的、有序的變化，以及各個組學層面之間的互動關系（圖6）。
該工作為今后人們繼續研究哺乳動物早期胚胎細胞性和多能性的開啟奠定了基礎，同時為體細胞克隆效率的提高以及早期胚胎發育異常的診斷與治療提供了新思路。
據悉，北京大學生命科學學院BIOPIC中心的博士后郭帆博士（現為四川大學研究員）、博士生李琳、李靜云為該論文的并列*作者；北京大學生命科學學院湯富酬研究員和四川大學郭帆研究員為這篇文章的共同通訊作者。該研究工作由北京大學和四川大學共同合作完成，并且得到了國家自然科學基金委員會、北京未來基因診斷高精尖創新中心，以及北大-清華聯合中心的資助。
湯富酬研究員簡介
湯富酬，現為北京大學生命科學學院BIOPIC中心研究員。1994 - 1998 , 本科畢業于北京大學，1998 - 2003 在北大獲得細胞生物學博士學位，2004 - 2010，英國劍橋大學Gurdon研究所，博士后， 2010年回國在北京大學組建實驗室，2015 - 現在 ,北大-清華生命科學聯合中心PI。主要從事人類早期胚胎發育的單細胞功能基因組學研究。在上系統發展了單細胞功能基因組學研究體系，并利用這一技術體系對人類早期胚胎發育進行了深入、系統的研究，揭示了人類早期胚胎DNA去甲基化過程的異質性以及其他關鍵特征，發現了人類早期胚胎中基因表達網絡的重要表觀遺傳學調控機理，為人們提供了一個全面分析人類早期胚胎DNA甲基化調控網絡的研究框架，加深了對人類原始生殖細胞的發育以及表觀遺傳重編程過程的認識。現已發表論文40多篇，被同行引用3000多次。其中20多篇論文是以通訊（或者共同通訊）作者身份發表在Cell，Nature，Science，Cell Stem Cell，Cell Research，Genome Research，Genome Biology等期刊上。其中兩項工作獲評2014年度中國科學進展，2015年度中國科學進展，以及2015年度生命科學領域進展。
郭帆研究員簡介
郭帆，博士，現任四川大學華西第二醫院研究員（PI）。2008年本科畢業于武漢大學生命科學學院；2014年在中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所獲得理學博士學位（導師：徐國良院士）；2014.04-2016.12在北京大學生物動態光學成像中心從事博士后研究（導師：湯富酬研究員）；2017.01-至今任四川大學華西第二醫院研究員。主要研究方向：基于單細胞功能基因組學測序技術、基因編輯技術以及干細胞體外定向分化技術等方法研究胚胎發育和疾病發生過程中的表觀遺傳調控機制。郭帆研究員近幾年在表觀遺傳學、單細胞表觀多組學測序等方面做出了一些列出色的工作，以*作者或通訊作者身份在Nature、Cell、Cell Stem Cell、Cell Research等雜志上發表多篇研究論文。其中，以*作者身份完成的Cell論文，入選“2015年度中國科學進展”，“2015年度中國高校科技進展” 以及“2015年度中國生命科學領域進展”。
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