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HB170102
【技術帖】NGS文庫質檢方法與注意事項
——文庫大小、質量、污染物評測
文庫的質量對于高通量測序（NGS）產出的數據質量至關重要。過低估計文庫的質量，導致Clusters或多重模板太多，數據質量不高；過高估計文庫的質量，導致數據讀取量少，基因組覆蓋率低，所以低估或者高估文庫質量都會影響測序效果。
那么，如何判斷你做出來的文庫是可以用于上機測序的，而不是白費力氣建了個沒用的文庫？或者更糟糕，構建出的文庫可以上機測序，但是得到了一堆沒有用的數據？
不要擔心，如果你的實驗設計精良，你只需要做3步簡單的質控就可以判斷文庫是否合格。
Bioanalyzer——文庫長度檢測
qPCR/Qubit——文庫定量
Nanodrop——文庫污染物檢測
1. 文庫長度檢測
文庫長度檢測是文庫質控的關鍵步驟。測序上機時，要求文庫等摩爾上樣（否則可能造成不同文庫簇生成密度不同，而影響測序質量），文庫的平均長度是計算文庫摩爾數的要素之一。
文庫摩爾數（pmol）≈ 文庫質量(ng)/ [0.66×文庫平均長度（bp）]
Agilent Bioanalyzer是進行文庫長度檢測zui常用的儀器，它基于微控流技術對樣本進行分離檢測。根據加樣要求，在DNA芯片中加入Ladder、Marker、Gel、Dye以及Sample，當給芯片加入電壓時，樣品便在芯片上的顯微蝕刻管道中進行毛細管電泳，在樣本流動過程中，不同DNA根據其大小被分離。同時凝膠-染料基質中的熒光染料可嵌入DNA雙鏈，通過激光激發熒光，使其被儀器檢測到，儀器依據收集到的熒光信號強度對樣本粗略定量。
一般情況下，好的文庫應該呈現出單一的、圓滑的峰，且接近正態分布，長度范圍在150-700bp之間。如下圖為使用100 ng E.coli gDNA建庫，接頭連接后進行雙輪分選（0.6×/0.2×和0.55×/0.15×）的檢測結果。
有時，文庫也可能在150-700bp的范圍之外出現雜峰。不同的雜峰大小與峰形可參照以下情況進行分析和實驗改進。
1) 在150bp以下出現雜峰
這種情況可認為是文庫擴增時的引物二聚體殘留或接頭殘留導致的，可以通過稍微降低磁珠使用比例重新純化文庫解決。注意，磁珠使用過程中的移液操作，切勿擾動磁珠。
2）在700bp以上出現雜峰
這種情況可認為是文庫擴增循環數過高，出現文庫過度擴增自我交聯導致的，可以通過文庫重新分選解決。
3）整個文庫呈現大小不對稱
這種情況可認為文庫分選操作不良或Input DNA的片段化不*導致的，可以通過重新進行文庫分選或者重新構建文庫解決。
2. 文庫濃度檢測
文庫質量也是計算文庫上機摩爾數的要素。常規使用qPCR法和熒光計法（以Qubit®常用）。
1）qPCR法
qPCR法使用特異性引物僅定量樣品中兩端接頭連接完整的文庫（即可測序的文庫），可排除單端或雙端都不連接接頭的不可測序文庫的干擾，是目前業內進行文庫定量的金標準。使用qPCR法時，需要以不同濃度的已知長度DNA的片段（常為452bp）作為標準品進行標曲制作，進而進行文庫定量。
由于標準品與文庫的實際長度可能不同，因此計算時，需要對文庫質量進行校正。
原始文庫濃度（nM）= [452 bp /文庫平均長度（bp）] × 稀釋文庫的濃度（pM）× 稀釋倍數/1000
一般情況下，理想的文庫濃度應在10-100nM之間。如果文庫測定結果在100nM以上，表明文庫的PCR循環數過高，這可能會增加測序數據中的Duplicate rate，此時可以通過減低1個PCR循環數來獲得10-100nM之間的文庫。
為了獲得的定量結果，在使用qPCR方式進行文庫定量時，建議遵循以下原則：
Ø 等量分裝qPCR Mix和DNA標準品，避免模板污染和反復凍融的影響
Ø 在進行qPCR之前，將反應體系配制區和模板制備區進行物理隔離，并定時使用0.5%次氯酸鈉或10%漂白劑對各實驗區域進行擦拭清理。
Ø 待測樣本做梯度稀釋，并且同時做3個平行重復
Ø 檢查梯度稀釋液以及平行樣本具有一致性的可重復的測定值
Ø 檢查確定待測文庫Ct在標準曲線以內時，使用標準曲線計算文庫濃度
2）熒光計法（Qubit®, Picogreen）
Qubit®是核酸和蛋白定量熒光儀，采用熒光染料檢測特定目標分子的濃度，能夠對DNA和RNA進行定量。Picogreen是一種極為靈敏的熒光核酸染料，其僅在與DNA雙鏈結合后才發出熒光，且所產生的熒光與DNA濃度呈正比，是定量DNA文庫的zui常用染料。
由于染料與DNA雙鏈結合，但無法有效區分文庫雙鏈和其他不完整雙鏈結構（如單端連接接頭產物或未連接接頭產物），所以相對qPCR法定量文庫來說，Qubit®方法的度稍弱一些，但是Qubit®出眾的簡便性、靈敏度以及低成本使得Qubit®成為測序實驗室*的儀器之一。此外，Input DNA由于沒有添加接頭，是無法使用qPCR方式定量的，此時Qubit®方法相對其他如Nanodrop等方法來說，是zui為的方法。
使用Qubit®熒光計方法得到的文庫濃度以ng/μL為單位，而測序上機文庫以nM（nmol/L）為單位，因此測定值需要根據以下公式進行換算：
文庫摩爾數（nM）≈ 文庫質量(ng/μL)×106/[660×文庫平均長度（bp）]
3. 文庫污染物檢測
Nanodrop是檢測樣本污染物zui快的方法之一，能夠在包括紫外及可見光區域在內的光譜范圍內檢測污染物的吸光度信號，核酸污染物的常用參考標準是A260/280和A260/230。
理想文庫的標準是A260/280>1.8，A260/230>2.0，不在該范圍時，建議重新進行文庫純化或者重新建庫，否則，可能造成文庫簇生成量少，測序數據質量差。
需要注意，不要使用Nanodrop做建庫過程中的DNA或RNA定量！
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