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實驗原理

若將可溶性的鼻疽抗原吸附在比其體積大千萬倍的紅細胞表面上，使紅細胞產生一種新的血清學性質，制成所謂的致敏紅細胞，即可用以診斷鼻疽。只要與少量相應抗體相遇，紅細胞通過抗原抗體反應，即可被動地結合在一起，呈現肉眼可見的凝集現象，陰性者紅細胞由于自然沉積于孔底，則呈圓點狀。這樣可以明顯地提高反應的敏感性。

間接血凝試驗即間接紅細胞凝集試驗，它也存在一些缺點，例如不同批次制備的抗原或紅細胞，在敏感性和穩定性方面，可能不一致，它很容易受外界因素的影響，發生非特異性凝集，所以應用的器皿等就應當清潔，不要有污物或雜質等，遇到非特異凝集時，要做間接凝集抑制試驗(indirect hemagglutination inhibition test)，以排除非特異性反應。

實驗試劑

1. 磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)的配制：

   甲液：Na₂HPO₄ 21.3 g (或Na₂HPO₄?12H₂O 53.72 g) NaCl 8.5 g

   乙液：KH₂PO₄ 20.42 g NaCl 8.5 g

上述甲、乙液配方各加蒸餾水至1000ml，溶解后，過濾，分別保存。使用時，將甲、乙液混合，再加等量的蒸餾水即配成0.15mol/L不同pH值的PBS，搖勻滅菌備用。

   pH值甲液：0.15mol/L Na₂HPO₄、NaCl

   乙液：0.15mol/L KH₂PO₄ NaCl

2. 1%兔血清緩沖鹽水的配制：將新分離的兔血清56℃ 30min滅活后，取所需量(如10ml)加約半量(如0.5ml)的洗過的壓積綿羊紅細胞，并加兔血清量4倍(如4ml)的pH值7.2 PBS，置37℃水浴箱中作用10min，以吸收兔血清中的異嗜性凝集素，1500 r/min離心10min，吸取上清，加pH值7.2 PBS 9.5ml，即為1%兔血清PBS液，置4℃冰箱中，可保存2天。

3. 阿氏液(Alsever’s solution)的配制：按以下配方配制，調正pH值6.1，過濾后分裝小瓶，以113℃高壓蒸氣滅菌15min后，置4℃冰箱中備用。

   枸櫞酸鈉(Na₃C₆H₅O₇?5H₂O)0.8 g

   葡萄糖2.05 g

   枸櫞酸0.0325 g

   氯化鈉0.42 g

蒸餾水加至100 ml

4. 紅細胞：無菌采取綿羊血液于阿氏液中，于4℃冰箱中保存，可供3周內使用。

5. 固定劑：25%戊二醛溶液。

6. 鞣酸溶液：所用鞣酸必須是純品，用前用雙餾水配成1/200溶液(使用時，再用pH值7.2 PBS配成所需濃度)，放4℃冰箱中保存，可供一周內使用。

7. 鼻疽抗原及被檢馬血清(56℃ 30min滅活)。

實驗設備

1. 血清反應板：為有機玻璃(聚甲基丙烯酸甲酯)制成，目前常用的為96孔板，長132cm，寬84cm，厚12cm。板孔的形狀基本有兩種，即尖底的(V形)和圓底的(U形)，其中V形板可供血凝試驗用，它較U形板具有更典型的凝集終點；U形板用于補體結合試驗較好。96孔V形板的孔徑為0.6cm，每孔的總容量為0.25ml。

用過的血清板，可以0.1%新潔爾滅、3%～5%次亞氯酸鈉或5%甲醛溶液浸泡1～2h，或用紫外線消毒，但不能用來蘇兒，因它可使血清板變色，如為無傳染性的被檢材料，可直接用清水沖洗3～4次后，晾干備用。由于血清板的硬度不夠，容易擦毛，所以洗擦時，可用紗布輕抹，不能用手指或硬布擦表面，以免發毛。清洗時，水溫不能超過90℃，以免變形。

2. 微量滴管：國內尚無定型產品，可自行加工。所用玻璃滴管長約20cm，于1/4處有一球形膨大部，下端接針頭處為磨口的，把16G號針頭磨平(即將針尖適當磨鈍，以調正液滴大小，使每毫升恰為40滴)，使每滴量為0.025ml，上端接小乳頭。加液時，要使滴管與血清板成垂直位置，以盡量使每滴液體的量相同。

3. 稀釋棒：金屬制品。全長約20cm，頭部為合金鋼制成，呈灰白色(氧化的金屬)，表面微粗糙些，以達到有效地吸取液體和吸取液體的一致性，為了長期保持棒頭的氧化層，吸取的即便不是帶菌的液體，每使用20次，棒頭也應過火一次，可燒至暗紅色，但不能燒至鮮紅。棒頭能蘸吸、移液和混合液體，能吸取液體是由于毛細管的作用和表面的粘附作用。目前國內制造的棒頭上有8條縱溝，吸液量為0.025ml。

4. 微量血液振蕩器：為特制其振搖血清板的，可使孔內的各要素混合的更均勻。

實驗步驟

1. 紅細胞的致敏方法

   1) 紅細胞醛化：用新鮮紅細胞作間接血凝，不但紅細胞凝集的模型新鮮、典型，而且敏感性也好，但致敏紅細胞保存的時間短，而且由于不同批次或不同動物個體的細胞具有一定的差異，可造成試驗結果不一致，影響對結果的分析。為了克服這一缺點，目前多采用醛化法(如甲醛、戊二醛或丙酮醛)固定紅細胞，制備致敏紅細胞。經醛化的紅細胞在普通冰箱中?保存1年以上，而且無明顯的溶血現象，致敏后的紅細胞敏感性，一般來說，與新鮮紅細胞沒有明顯的差別。

取阿氏液保存的血液，用pH值7.2 PBS洗3次，每次均為3000r/min 3min，zui后一次去上清，取沉積的紅細胞2.5ml，加1%戊二醛(取25%冷戊二醛10ml和pH值7.2 PBS 240ml混合制成) 250ml，于4℃冰箱中醛化50min，中間振搖4~5次，取出后仍呈深紅色，極粘稠地沉積于離心管底，須強力方能攪拌起來，再以pH值7.2 PBS連續洗3次，每次均為3000r/min 3min，zui后一次去上清，加入含0.01%硫柳汞的pH值7.2 PBS 22.5ml，即為10%戊二醛化紅細胞液，置4℃冰箱中保存zui少可用1年。

   2) 醛化紅細胞鞣酸化：以10%醛化紅細胞12ml，加pH值7.2 PBS 8ml，以3000 r/min離心3min，如此洗2次，去上清，再加pH值7.2 PBS 4ml，即為3%紅細胞懸液，加4ml 1∶20 000鞣酸(1/200鞣酸用pH值7.2 PBS稀釋)，于37℃水浴中加溫15min，其間不斷振搖，使之充分作用，加溫完畢，以pH值7.2 PBS洗2次，每次均3000 r/min 3min，傾去上清，加4ml pH值7.2 PBS，即為3%鞣酸化紅細胞液。

   3) 鞣酸化紅細胞致敏：取鼻疽補反用抗原，以pH值6.4 PBS將其1∶100稀釋，以4ml稀釋的抗原加往鞣酸化紅細胞液4ml中，于37℃水浴中作用30min，以3000 r/min離心3min，去上清后，再加8ml 1%兔血清緩沖鹽水，即為間接血凝用15%致敏紅細胞診斷液(須加0.01%硫柳汞防腐)，置普通冰箱中可保存0.5～1年。對照用紅細胞診斷液，按上述方法以pH值6.4 PBS處理鞣酸化紅細胞即可。

操作方法

2. 實施反應的操作方法：用微量滴管吸取1%正常兔血清pH值7.2 PBS分別滴加于血清板相鄰兩列孔中，每孔一滴即0.025ml，再取2支預濕的棒頭(先通過火焰燒紅、冷卻，放蒸餾水或生理鹽水的液面上預濕1min，注意不能將整個棒頭都浸到液體中，否則會有殘留液體，造成不正確的結果，再用吸水紙吸潮、校準)分別蘸取1∶100稀釋的被檢血清(56℃ 30min加熱滅活)0.025ml，各插入上下二列的第1孔稀釋液中，進行捻轉對倍稀釋，捻轉稀釋棒的速度要適當，太慢混合不均，太快易造成泡沫，使得稀釋不準，通常每秒鐘捻轉2～3次為適宜，稀釋后血清第1～7孔的稀釋度分別為1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800，第8孔不加血清，為1%兔血清PBS對照。再用微量滴管吸取鼻疽抗原致敏的紅細胞診斷液往*列的每一孔中滴加0.025ml，再換另一支微量滴管吸取對照用鞣酸化細胞液滴加于第二列的每一孔中，每孔也為0.025ml。然后將血凝反應板置于微型血液振蕩器上，振搖3～5min，充分混勻，取下反應板，將其放于事先鋪有濕紗布的搪瓷盤內，置37℃恒溫箱中1～15h(夏季放室溫下也可以)，取出觀察結果，必要時放室溫下過，再一次觀察反應結果，并作終判。

3. 結果判定

判定時，應首先看對照孔，只有在各個對照孔*正確的情況下，說明反應條件正常，方可對被檢血清列的結果作判定。

注意事項

1. 紅細胞也可用新鮮的，但凝集模型不穩定，且不能長期保存，如現用現采，不能保證各次試驗結果的一致性。

2. 所用紅細胞的種類除綿羊細胞以外，還可應用人的O型紅細胞，及雞、馬的紅細胞等。

3. 被檢標本的稀釋應力求準確，特別是使用稀釋棒進行稀釋時，稀釋棒的旋轉次數或時間應相對固定，一般每個稀釋度可旋轉稀釋50～100次，稀釋棒應盡量不碰及血清板邊緣。

4. 血凝試驗中，所用致敏紅細胞濃度，對試驗結果的敏感度影響很大，一般說，紅細胞濃度偏高，則終點效價低，紅細胞濃度低，則終點效價高，故紅細胞濃度力求準確穩定。

5. 稀釋液中的正常兔血清須經56℃ 30min滅能，并用與致敏同批號的綿羊紅細胞充分吸收，以去除非特異性凝集素。

6. 稀釋棒用畢，以水沖洗干凈，用濾紙將水吸干，于火焰上將棒頭燒紅，冷卻后再用