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【感受態(tài)細(xì)胞的制備】 電擊和熱擊感受態(tài)細(xì)胞的制備

2013-5-15　　閱讀(1964)

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實(shí)驗(yàn)試劑

LB培養(yǎng)基，KB培養(yǎng)基，10%甘油，液氮，0.1M CaC12 溶液

實(shí)驗(yàn)設(shè)備

超凈工作臺，搖床，離心機(jī)，250mL離心瓶，0. 5mL的離心管

實(shí)驗(yàn)材料

大腸桿菌，農(nóng)桿菌和假單胞桿菌

實(shí)驗(yàn)步驟

 

1. 電擊感受態(tài)細(xì)胞的制備

    1） -80℃ 保存的大腸桿菌，農(nóng)桿菌或者假單胞桿菌在固體平板上（DH，BL21在LB平板上，GV3101在LB/Gen; P.s. pv. tomato 0288-9和P. syringae pv. tabaci 6505在KB平板上）劃線。

    2） 接種單克隆于5-10mL液體培養(yǎng)基，37℃ （大腸桿菌）或者28℃ （農(nóng)桿菌和假單胞桿菌）培養(yǎng)過夜。

    3） 按照1:100-1:500轉(zhuǎn)接到500-1000mL液體培養(yǎng)基，37℃ 培養(yǎng)3-4小時(shí)（大腸桿菌）或28℃ 培養(yǎng)8-10小時(shí)（農(nóng)桿菌和假單胞桿菌轉(zhuǎn)化）至細(xì)菌達(dá)到對數(shù)生長期。

    4） 將菌液裝入250mL離心瓶中，冰上放置30分鐘后，4℃ 離心15分鐘。

    5） 棄上清，加入200mL 10%甘油，于冰上緩慢將菌搖散，4℃ 離心15分鐘。

    6） 重復(fù)前一步驟2-3次，zui后棄上清，加入少量10%甘油重懸細(xì)菌。

    7） 分裝于0. 5mL的離心管中，每管40ul，液氮速凍，-80℃ 存放。

2. 熱激感受態(tài)的制備

    1） 挑取E.coli BL21單克隆接種到5mL LB培養(yǎng)液中，37℃ 振蕩培養(yǎng)過夜。

    2） 按照1:100-1:500轉(zhuǎn)接到500-1000mL液體培養(yǎng)基，37℃ 培養(yǎng)3-4小時(shí)至細(xì)菌達(dá)到對數(shù)生長期。

    3） 將菌液裝入250mL離心瓶中，冰上放置30分鐘后，4℃ 離心15分鐘。

    4） 棄上清，加20mL預(yù)冷的0.1M CaC12 溶液輕輕懸浮菌體，冰上放置15-30分鐘后于4℃ 離心5分鐘。

    5） 棄上清，加2mL冰預(yù)冷的0.1M CaC12 溶液，重懸菌體。

    6） 分裝于0. 5mL的離心管中，每管40ul，液氮速凍，-80℃ 存放。

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