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RFLP和RAPD技術
點擊次數：875 發布時間：2017-8-28
*節概述
DNA分子水平上的多態性檢測技術是進行基因組研究的基礎。RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,限制片段長度多態性)已被廣泛用于基因組遺傳圖譜構建、基因定位以及生物進化和分類的研究。RFLP是根據不同品種（個體）基因組的限制性內切酶的酶切位點堿基發生突變，或酶切位點之間發生了堿基的插入、缺失，導致酶切片段大小發生了變化，這種變化可以通過特定探針雜交進行檢測，從而可比較不同品種（個體）的DNA水平的差異（即多態性），多個探針的比較可以確立生物的進化和分類關系。所用的探針為來源于同種或不同種基因組DNA的克隆，位于染色體的不同位點，從而可以作為一種分子標記(Mark)，構建分子圖譜。
當某個性狀（基因）與某個（些）分子標記協同分離時，表明這個性狀（基因）與分子標記連鎖。分子標記與性狀之間交換值的大小，即表示目標基因與分子標記之間的距離，從而可將基因定位于分子圖譜上。分子標記克隆在質粒上，可以繁殖及保存。不同限制性內切酶切割基因組DNA后，所切的片段類型不一樣，因此，限制性內切酶與分子標記組成不同組合進行研究。常用的限制性內切酶一般是HindⅢ，BamHⅠ,EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,而分子標記則有幾個甚至上千個。分子標記越多，則所構建的圖譜就越飽和。構建飽和圖譜是RFLP研究的主要目標之一。
運用隨機引物擴增尋找多態性DNA
段可作為分子標記。這種方法即為RAPD(RandomamplifiedpolymorphicDNA，隨機擴增的多態性DNA)。盡管RAPD技術誕生的時間很短,但由于其*的檢測DNA多態性的方式以及快速、簡便的特點,使這個技術已滲透于基因組研究的各個方面。該RAPD技術建立于PCR技術基礎上,它是利用一系列(通常數百個)不同的隨機排列堿基順序的寡聚核苷酸單鏈(通常為10聚體)為引物,對所研究基因組DNA進行PCR擴增.聚丙烯酰胺或瓊脂糖電泳分離,經EB染色或放射性自顯影來檢測擴增產物DNA段的多態性,這些擴增產物DNA段的多態性反映了基因組相應區域的DNA多態性。
RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同,但對于任一特異的引物,它同基因組DNA序列有其特異的結合位點.這些特異的結合位點在基因組某些區域內的分布如符合pcr擴增反應的條件,即引物在模板的兩條鏈上有互補位置,且引物3’端相距在一定的長度范圍之內,就可擴增出DNA段.因此如果基因組在這些區域發生DNA段插入、缺失或堿基突變就可能導致這些特定結合位點分布發生相應的變化,而使PCR產物增加、缺少或發生分子量的改變。通過對PCR產物檢測即可檢出基因組DNA的多態性。分析時可用的引物數很大,雖然對每一個引物而言其檢測基因組DNA多態性的區域是有限的,但是利用一系列引物則可以使檢測區域幾乎覆蓋整個基因組。因此RAPD可以對整個基因組DNA進行多態性檢測。另外，RAPD片段克隆后可作為RFLP的分子標記進行作圖分析。
本實驗將學習RFLP的酶切,電泳和膜的制作以及RAPD技術。探針標記及雜交檢測方法請另詳見分子雜交技術。
第二節RFLP技術
一、材料
基因組DNA(大于50kb,分別來自不同的材料)。
二、設備
電泳儀及電泳槽，照相用塑料盆5只，玻璃或塑料板(比膠塊略大)4塊，吸水紙若干，尼龍膜(依膠大小而定)，濾紙，eppendorf管(0.5ml)若干。
三、試劑：
1、限制性內切酶(BamHⅠ,EcoRⅠ,HindⅢ,XbaⅠ)及10×酶切緩沖液。
2、5×TBE電泳緩沖液：配方見*章。
3、變性液：0.5mol/LNaOH，1.5mol/LNaCl。
4、中和液：1mol/LTris·Cl,pH7.5/1.5mol/LNaCl。
5、10×SSC：配方見第九章。
6、其它試劑：0.4mol/LNaOH，0.2mol/LTris·Cl,pH7.5/2×SSC，ddH2O，Agarose0.8%，0.25mol/LHCl。
四.操作步驟
1.基因組DNA的酶解
(1)大片斷DNA的提取詳見基因組DNA提取實驗,要求提取的DNA分子量大于50kb,沒有降解。
(2)在50μl反應體系中,進行酶切反應:
5μg基因組DNA
5μl10×酶切緩沖液
20單位（U）限制酶(任意一種)
加ddH2O,至50μl