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聚合酶鏈反應[PCR]
點擊次數：772 發布時間：2017-8-14
聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction）即PCR技術是美國Cetus公司人類遺傳研究所的科學家K.B.Mullis于1983年發明的一種體外擴增特定基因或DNA序列的方法。PCR具有很高的特異性、靈敏度，在分子生物學、基因工程研究、某些疾病的診斷以及臨床標本中病原體檢測等方面具有極為重要的應用價值。
雙鏈DNA分子在接近沸點的溫度下解鏈，形成兩條單鏈DNA分子（變性），與待擴增片段兩端互補的寡核苷酸（引物）分別與兩條單鏈DNA分子兩側的序列特異性結合（退火、復性），在適宜的條件下，DNA聚合聚利用反應混合物中的4種脫氧核苷酸（dNTP），在引物的引導下，按5’-----3’的方向合成互補鏈，即引物的延伸。這種熱變性、復性、延伸的過程就是一個PCR循環。隨著循環的進行，前一個循環的產物又可以作為下一個循環的模板，使產物的數量按2n方式增長。從理論上講，經過25-30個循環后DNA可擴增106-109倍。
除上述典型的PCR反應外，人們還根據各種用途設計了各種不同類型的特殊PCR。如利用反轉錄PCR（RT-PCR），即利用組織mRNA進行反轉錄后合成*鏈cDNA，以此為模板經PCR合成特定目的基因；反向PCR，常規PCR允許擴增兩條引物之間的DNA片段，而反向PCR則可以對靶DNA區域之外的兩側未知的DNA序列進行擴增；不對稱PCR使用的引物濃度不同，兩種引物濃度相差100倍，在zui初的20個循環中主要產物是雙鏈DNA，當低濃度引物被消耗后，高濃度引物引導的PCR反應產生大量單鏈DNA分子，可用于DNA的序列測定；在PCR-ELISA中，將引物用地高辛、生物素或放射性同位素標記，再進行PCR擴增，用ELISA方法檢測反應產物的靈敏度可提高百倍以上；采用定量PCR，即用熒光物質標記引物，根據反應進程中熒光變化情況，可以確定組織中mRNA含量，從而了解不同生長發育時期組織特定基因的表達水平等。
影響pcr反應結果的因素較多，主要包括
（1）模板的質量：在制備模板DNA時通常需要使用蛋白變性劑及乙醇等有機溶劑，這些物質可直接影響PCR反應；另外當模板DNA分子量很高時，解鏈不易，可用限制酶消化以改善擴增效果；從理論上說，一個模板DNA分子即可獲得擴增產物，模板濃度過高，PCR反應的特異性下降，實際操作中可按1ng、0.1ng、0.01ng遞減的方式設置模板濃度對照。
（2）引物：引物是決定PCR結果的關鍵，引物設計在PCR反應中極為重要。要保證PCR反應能準確、特異、有效地對模板DNA進行擴增，通常引物設計要遵循以下幾條原則：
①引物的長度以15-30bp為宜，一般（G+C）的含量在45-55%，Tm值高于55℃［Tm=4(G+C)+2(A+T)］。應盡量避免數個嘌呤或嘧啶的連續排列，堿基的分布應表現出是隨機的。
②引物的3’端不應與引物內部有互補，避免引物內部形成二級結構，兩個引物在3’端不應出現同源性，以免形成引物二聚體。3’端末位堿基在很大程度上影響著Taq酶的延伸效率。兩條引物間配對堿基數少于5個，引物自身配對若形成莖環結構，莖的堿基對數不能超過3個由于影響引物設計的因素比較多，現常常利用計算機輔助設計。