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DNA芯片檢測siRNA專一性
點擊次數：754 發布時間：2017-7-18
長片斷的雙鏈RNA (dsRNA) 導入例如植物，真菌，果蠅，線蟲等生物的細胞中會引發同源mRNA的降解——這就是所謂的RNA interference (RNAi)。RNAi分兩個步驟，首先是長片斷雙鏈dsRNAs被核酶Dicer切割成21—25個堿基的small interfering RNAs (sirnas)。這些siRNA隨后和相關蛋白組合成為RNA-induced silencing complex (RISC) ，這個復合物以同源mRNA為靶摧毀mRNA。兩年前Elbashir and Tuschl用siRNA在哺乳動物細胞中成功引發特異基因的沉默，從此siRNA廣泛應用于這個領域。
siRNA介導的基因沉默通常要求高度的序列專一。Tuschl和同事證實siRNA和mRNA之間一個堿基的錯配都會導致基因沉默的失敗，當然這并不排除由siRNAs 引發的非特異基因沉默。siRNAs也有可能會引發一系列的部分同源的mRNAs沉默，甚至有可能象超過30個堿基的長片斷dsRNA一樣通過引發抗病毒反應—— 一種通常由于機體對抗病毒入侵產生的反應，包括由蛋白激酶R和后繼的EIF2a磷酸化激活的蛋白合成阻斷，以及由 RNase L激活的非特異RNA降解。
這就意味著需要在全基因組范圍內對siRNA的專一性進行檢測。2003年5月出版的The Proceedings of the National Academy of sciences, USA, Patrick Brown和同事采用DNA芯片的方法對siRNAs的專一性在全基因組范圍內進行了檢查。
Brown和同事檢查了兩個針對外源GFP基因的siRNAs的專一性，結論是關閉外源的GFP表達不會間接影響其他細胞內源基因的表達水平。2個GFP特異的siRNAs和兩個隨機無意序列對照siRNAs分別被轉染能瞬時或者持續表達GFP的人源293細胞，結果通過GFP熒光水平檢測和FACS分析，GFP特異的siRNAs能夠沉默70%的GFP表達而對照則對GFP表達沒有影響。從轉染和沒有轉染siRNAs的細胞中分離RNA，標記后和點有36000個人類基因的cDNA 芯片雜交。其中約有20000個基因在293細胞中表達。結果表明這20000個基因中沒有一個的表達水平在轉染了特異或非特異siRNAs后發生顯著變化。
對于RNAi 特異性的另一個關注焦點是：傳遞的RNAi（"transitive RNAi"）或者叫"secondary siRNAs"的產生。Transitive RNAi是在線蟲的實驗中發現的，也可能在其他生物中發生。在這個過程中，siRNAs，在變性后結合到互補的轉錄本上，通過RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase ，RdRP)在3"和5"端的延伸形成新的雙鏈dsRNAs。這些dsRNAs被加工成為"secondary siRNAs"。這些二級siRNAs，如果和其他基因有同源，可以導致其他基因表達的沉默，這樣就強化了非特異基因沉默的可能性。
到目前為止，在人類基因組中沒有發現 RNA依賴的RNA聚合酶(RdRP)，這提示在人類細胞中可能不會發生RNAi傳遞。然而這個假設并沒有被廣泛的驗證過。Brown和同事也檢測了在人源細胞中是否存在傳遞RNAi現象。他們將兩個報告基因(luciferase and GFP)分別和常見的actin序列融合，共轉染到293細胞中。他們檢測到一個報告基因的特異的siRNAs不能導致另一個報告基因沉默。結果表明傳遞RNAi機制在人類中不存在。
研究結果支持已有的假設：siRNAs在高度序列專一的條件下發揮作用，只能導致*互補的基因表達沉默。人類細胞不存在傳遞RNAi現象的實驗結果同樣證實這種專一性。
不過實驗受限于細胞類型和siRNAs類型，特別是外源基因的siRNAs。實驗結果仍然有待推廣到其他細胞類型，特別是內源基因的siRNAs，如果siRNAs在將來要應用于基因治療，這樣的實驗將尤為重要。