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線粒體的分離與觀察
點擊次數：1141 發布時間：2017-2-16
線粒體(mitochondria)是真核細胞中產生能量的重要細胞器。細胞中的能源物質—脂肪、糖、部分氨基酸在此進行zui終的氧化，并通過偶聯磷酸化生成ATP，供給細胞生理活動之需。對線粒體結構與功能的研究通常是在離體的線粒體上進行的。
制備線粒體時，可將組織勻漿液懸浮在懸浮介質中進行差速離心法進行分離。在一定的離心場中（選用離心機的一定轉速），大小不一的顆粒沉降速度取決于它的密度、半徑和懸浮介質的粘度。在一個均勻懸浮介質中離心一定時間，組織勻漿中的各種細胞器及其它內含物由于沉降速度不同而停留在高低不同的位置。依次增加離心力和離心時間，就能夠使這些顆粒按其大小、輕重分批沉降在離心管底部，從而分批收集。細胞器中zui先沉淀的是細胞核，其次是線粒體，其它更輕的細胞器和大分子可依次再分離。
懸浮介質通常用緩沖的蔗糖溶液，它比較接近細胞質的分散相，在—定程度上能保持細胞器的結構和酶的活性，在pH7.2 的條件下，亞細胞組分不容易重新聚集，有利于分離。整個操作過程應注意使樣品保持4℃，避免酶失活。
線粒體的鑒定用詹納斯綠活染法。
三、實驗用品
(一) 材料 小鼠12 只
（二）器材 冷凍高速離心機、解剖刀剪、小燒杯、冰浴、漏斗、尼龍網、玻璃勻漿器、PH 計、高壓滅菌鍋等。
（三）試劑 氯化鈉、詹納斯綠B、鹽酸、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、D(十)蔗糖、
甲醇、冰醋酸、雙蒸水、甘油、姬姆薩染料、KH2PO4 、Na2HPO4。
1．0.9%滅菌的生理鹽水。
2. 1%詹納斯綠B 染液，用0.9%滅菌的生理鹽水配制。
3. 0.25mol/L 蔗糖十0.01mo1/L Tris-鹽酸緩沖液(pH7.4)：
0.1mol/L 三羥甲基氨基甲烷(Tris) 10ml
0.1mol/L 鹽酸8.4ml
加重蒸水到100ml
加蔗糖到0.25mol/L。
4. 0.34mol/L 蔗糖十0.01mol/L tris-鹽酸緩沖液(pH7.4)
5. 固定液：甲醇：冰醋酸(9：1)
6. 姬姆薩染液（原液）：Giemsa 粉0.5g，甘油33m1，純甲醇33m1。先將Giemsa 粉置于研缽內中，加少量甘油研磨至無顆粒，再將剩余甘油倒入混勻，56℃左右保溫2h 令其充分溶解，zui后加甲醇混勻，成為姬姆薩原液，保存于棕色瓶。
7. 姬姆薩染液（應用液）：臨用時，吸出1ml 原液，用9ml 1/15mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS)作l0 倍稀釋。
8. 1/15mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH6.8)：
l/15mol/L KH2PO4 50ml
l/15 mol/L Na2HPO4 50ml
四、實驗操作
1. 制備小鼠肝細胞勻漿實驗前小鼠空腹12h，拉頸處死，剖腹取肝，迅速用生理鹽水洗凈血水，用濾紙吸干。稱取肝組織2g，剪碎，用預冷到0～4℃的0.25mol/L 緩沖蔗糖溶液洗滌數次。然后在0～4℃條件下，按每克肝加9ml冷的0.25mol/L 緩沖蔗糖溶液將肝組織勻漿化，蔗糖溶液應分數次添加。勻漿液用200 目銅篩過濾備用。