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公司技術：有機沉淀法總蛋白提取實驗技巧
點擊次數：949 發布時間：2013-4-1
從植物葉片提取的植物總蛋白不但是家養類動物生長發育的重要營養物質，而且是具有潛力的新一代營養保健食品，因而掌握植物葉蛋白的提取方法至關重要，讓我們一起了解這整個實驗原理和過程吧。
一、實驗目的
熟悉植物葉蛋白的幾種提取原理和方法，了解其意義及其應用價值。
二、實驗原理
植物葉蛋白或稱綠色蛋白濃縮物（leaf protein concentration，簡稱LPC），是從新鮮植物葉片中提取的高質量濃縮蛋白質，不僅是畜禽生長發育和生產畜產品的主要營養物質，而且目前也正成為人類的保健營養理想食品之一。天然蛋白存在于為數甚多的植物體內，對其分離應依據人們的利用目的及提取蛋白含量和品質加以考慮。
天然蛋白質一般在溶液中呈穩定的親水膠體狀態，故LPC 亦稱葉蛋白膠。其特點是：
（1）水化作用 即蛋白質分子表面附有能有效防止蛋白質分子沉淀析出的水化膜;（2）電荷排斥作用 水化膜外還有電荷層（具陰、陽離子）能有效地防止蛋白質分子的凝集。故溶液蛋白質顆粒（溶質）呈溶解狀態;（3）欲提取植物組織中的蛋白質必須利用溶解度的差異進行分離純化（如鹽析、有機溶劑分級沉淀法、疏水層析、結晶、加熱、離心分離等法），利用分子大小和形狀差異進行分離純化（分子篩層析法）;還可利用電荷性質的差異分離純化（離子交換法）。只要創造上述影響因素，即可使蛋白質從植物葉片中分離并沉淀出來。
植物葉蛋白提取一般遵循如下基本原則：盡可能提高樣品蛋白的溶解度，抽提zui大量的總蛋白，減少蛋白質的損失;減少對蛋白質的人為修飾;破壞蛋白與其他生物大分子的相互作用，并使蛋白質處于*變性狀態。根據該原則，植物葉蛋白制備過程中一般需要有四種試劑①離液劑：尿素和硫脲等;②表面活性劑：又稱去垢劑，早期常用NP-40、Tritonx-100等非離子型去垢劑，離子型去垢劑有SDS、膽酸鈉、LiDS 等，還有象CHAPS（含它的蛋白溶液可以凍存）與Zwittergent 等雙性離子去垢劑;
③還原劑：DTT、DTE、TBP、Tris-base 等;④蛋白酶抑制劑及核酸酶：EDTA、PMSF、蛋白酶抑制劑混合物（Protease inhibitor cocktails）等，如為了去除緩沖液中存在的痕量重金屬離子，可在其中加入0.1～5mmol/LEDTA，同時使金屬蛋白酶失活。
三、儀器和試劑
儀器
離心機、移液器、研缽、離心管、冰箱。
試劑
1. 20mL 樣品提取緩沖液：2.5mL 0.5mol/LTris-HCl
3. -20℃下預冷丙酮（含0.07%β-巰基乙醇）
4. -20℃預冷的80%丙酮（含0.07%β-巰基乙醇）
5. 飽和硫酸銨溶液 稱取（NH4）2SO4 80g，加蒸餾水100mL，加熱50～60℃，攪拌溶解，室溫過夜，用濃氨水調pH 至7.0
6. 0.05molpH7.0的磷酸緩沖液10%NaCl 0.1mol 醋酸95%乙醇
7. 植物葉片（草本植物、木本植物葉片等都可）
四、 實驗步驟
植物葉蛋白的提取主要有鹽析法、有機溶劑沉淀法、加熱法（含逐步和快速加熱）、 離心分離法、結晶和重結晶法等。依據今后的開發方向（以飼料為基礎，以食品、飲品為開發方向）及簡便易行和使用的原則，主要采用鹽析法、加熱法和有機溶劑法分離提取葉蛋白（冷提和熱提）。不同的提取方法，對樣品的處理方式、程度和要求不同，結果也有差異。
（一）（NH4）2SO4 沉淀法提取葉蛋白
取0.3g 植物葉蛋白，用液氮充分研磨轉入離心管中，加入3mL 提取緩沖液，搖勻并放在4℃條件下提取1h，充分溶解蛋白后，4℃10000r/min 離心20min，棄沉淀，上清液中加入（NH4）2SO4 ，混勻1h，按1：2（v/v）加入-20℃預冷的80%丙酮，混勻后4℃12000r/min 離心10min，沉淀在-20℃冰箱中放置20min，使丙酮*揮發后加適量上樣緩沖液，待沉淀充分溶解后，4℃12000r/min 離心5min，取上清液即為所提取的葉蛋白溶液。
（二）改良丙酮沉淀法提取葉蛋白
取0.3g 左右的植物葉片，用液氮研磨，色素多的可按材料鮮重的10%加入PVP，并將充分研磨過的樣品轉入離心管中，加入4mL 的提取緩沖液，搖勻并放在4℃條件下提取1h，充分溶解蛋白。放置后的樣品充分搖勻，4℃10000r/min 離心30min，棄沉淀，上清液中加入2.5～3倍體積的村-20℃條件下過夜，讓蛋白充分沉淀。之后，4℃10000r/min 離心30min，其上清，沉淀置于-20℃下，使丙酮*揮發，如有必要加入上樣緩沖液溶解沉淀。緩沖液用量300ul，沉淀充分溶解后，轉移至1.5mL 離心管中，4℃12000r/min 離心15min ，取上清液即為所提取的葉蛋白溶液。
該方法提取的蛋白質，提取效率高，雜質干擾少，電泳結果蛋白條帶清晰，數量多。
（三）植物葉片總蛋白的提取—三氯醋酸—丙酮沉淀法
①在液氮中研磨適量的葉片;
②懸浮于含10%的三氯醋酸和含0.07%β-巰基乙醇（可用DTT 代替）的丙酮溶液在-20℃條件下冰浴;
③讓蛋白質沉淀過夜后離心（4℃ 10000r/min 離心30~60min），棄上清;
④重懸沉淀浮于含0.07%β-巰基乙醇的預冷丙酮溶液中;
⑤離心（同上）后真空干燥沉淀;
⑥用上樣緩沖液溶解沉淀，離心;
⑦Brandford 法定量蛋白，然后分裝至Eppendof 管中保存在-78℃備用。
（四）分步提取可溶性葉蛋白
（1）蛋白質浸出 ①水溶性蛋白質浸出：用0.05molpH7.0的磷酸緩沖液（或蒸餾水）將樣品制成勻漿液，然后離心15min（4000r/min），收集上清液即蛋白質浸出液，再將沉淀物按上述操作重復兩次。②鹽溶性蛋白質浸出用10%NaCl 將前者剩余沉淀物分離提取兩次，收集蛋白質浸出液。
（2）蛋白質沉淀用0.1mol 醋酸將蛋白質浸出液pH 值調至蛋白質等電點（pH4.5左右），即8體積蛋白質浸出液加入1體積0.1mol 醋酸，混勻，離心15min（3000r/min），棄去上清液，沉淀物即為可溶性葉蛋白。
（3）蛋白質收集于沉淀物中加入95%乙醇，混勻，用定量濾紙過濾或抽濾，待風干后收集。