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金標法是Faulk和Taylor（1971）提出的，并首先用于免疫電鏡。它是利用膠體金在堿性環境中帶有負電的性質，使其與抗體相吸附，從而將抗體標記。當用金標記的抗體與抗原反應時，在光鏡水平膠金液呈現鮮艷的櫻紅色，不需加外進行染色。在電鏡水平，金顆粒具有很高的電子密度，清晰可辨。因此，免疫電鏡膠體金標記法近年來被成功地應用于生物學的各個方面，并取得了要喜的進展，解決了一些過去未能解決的問題，80年代以來似有取代免疫電鏡PAP技術的趨勢。膠體金標記抗體技術在電鏡水平應用有許多優點：首先，手續不如PAP法煩瑣，不需用H2O2等損傷微細結構的處理步驟，對微細結構的影響較少。其次，金顆粒具有很高的電子密度，在電鏡下金顆粒清晰可辨，易于與其他免疫產物相區別。因此，金標法還可以和PAP法相結合進行雙重或多重染色的超微結構定位。另外，利用不同直徑的金顆粒標記不同的抗體，是研究突觸小泡內神經遞質共存的有力工具。由于抗原抗體反應部位結合金顆粒數量的多少可進行粗略的免疫細胞化學定量研究。金標抗體還可加入培養液中，對培養細胞內抗原進行標記定位。曾有報告用金標記法于細胞內骨架的研究獲滿意的效果。由于金具有強烈的繼發電子的能力，因此，不僅可以用于透射電鏡的超薄切片觀察，也可以用于掃描電鏡對細胞表面的抗原、受體進行標記定位觀察。金標液無毒性，對人體無損傷。膠體金及膠體金標記物的制備見第五章第3節。在原位分子雜交技術在電鏡水平的應用中，膠體金的標記術被科技工作者認為是當前的標記物。

一、電鏡水平的免疫金染色法

應用于電鏡水平的免疫法，可分為包埋前染色和包埋后染色，由于包埋前染色對細胞膜的穿透性差，一般只用于細胞表面的抗原標記，如需穿透細胞膜，則需輔以凍融法或加入TritonX-100、皂素等活性劑，后者會加重細胞超微結構的破壞，因此，現較普遍采用包埋后染色，現分別介紹如下：

1、包埋后染色

（1）超薄切片厚50～70nm左右，載于200～300網孔的鎳網上。

（2）置1%H2O2內10min至1h（視樹脂的硬度和切片的厚度而定），以去鋨酸和增進樹脂穿透性，有利抗體進入。如切片很薄或于低溫包埋時，此步可省略。操作時，滴入1%H2O2液1滴于蠟板上，將網的載片面輕浮于液滴上。對中樞神經系統切片，有主張以1%過碘酸鉀（KIO4）代替H2O2的。

（3）雙蒸水洗3次，每次10min，第1，2次洗法如（2），浮于液滴上，第3次以盛雙蒸水的注射器沿鎳網面沖洗，水流應有適當壓力，但不宜過高強，用濾紙在網緣將水吸干。

（4）浮于正常羊血清（1：50～1：100）滴上，室溫30～60min，以飽和固定劑中的游離醛基占據非特異性結合部位。

（5）PBS漂洗3min，洗1次（有人主張不洗）。

（6）濾紙吸干，孵育于*抗體血清滴上，先室溫預孵1h，再置于4℃24～36h.

（7）PBS漂洗3min，3次。

（8）PBS（內含1%的牛血清白蛋白）pH8.2中，5min，此步為膠體金結合作準備。

（9）膠體金標記抗體液1：30～1：100，淡紅色為適宜稀釋液，室溫孵育10min至1h.

（10）雙蒸水洗3min，3次。

如作雙重染色，則應將鎳網翻過來，用另一類抗體血清，重復上述步驟（2）～（10）。

（11）5%醋酸鈾（雙蒸水配制）染5min，然后用雙蒸水洗。

（12）枸櫞酸鈾（或醋酸鉛）染色5min，雙蒸水洗凈。

（13）電鏡觀察。

2、包埋前染色

（1）組織經過適當固定，為增強細胞穿透性，可在固定液中加入皂角素（Saponin），使其濃度為0.01%，經含皂角認固定劑處理5～8min后，應用0.01mol/lPBSPh7.4沖洗12h左右，中間換洗3～4次。

（2）組織切片貼于明膠涂抹的坡片上，細胞可制成混懸液，用離心法操作或制成涂片。

（3）0、05mol/lPBSpH7.4洗3min.

（4）以1：5正常羊血清處理切片30min室溫，以阻斷非特異性吸附。

（5）*抗體4℃孵育20h后室溫2h或過夜。

（6）0、05mol/lTBSpH7.4洗3min×3.

（7）0、02mol/lTBSpH8.2洗3min×3，為與膠體金結合作準備。

（8）再次阻斷非特異性吸附，同（4）。

（9）以金標記的第二抗體（工作濃度1：40左右）在室溫下孵育1h.

（10）0、05mol/lTBSpH8.2洗3min.

（11）0、05mol/lTBSpH7.4洗3min×3

（12）1%鋨酸（0.1mol/lPBS溶液）1h.

（13）雙蒸水洗15min.

（14）系列酒精或丙酮脫水，包埋、超薄切片。（15）枸椽酸鉛對照染色。

為增加抗非特異性染色，有的實驗室傾向在TBS中加入1%小牛血清白蛋白（BovineSerumAlbumin,BSA,Sigma）。理想的免疫金染色切片，背景應清潔，無殘留的金或其他無機鹽顆粒，金粒集中在抗原、抗體反應部位。要獲得理想的免疫金染色切片，需注意的因素很多，其中主要的如：①抗體血清的高度特異性和親和力;②被檢組織應有較高濃度的抗原;③沖洗液的清潔度，沖洗的*程度以及整個過程中應用的各種器皿的清潔度等;④所有溶液用微孔濾過器（miliporefilter濾過），濾膜孔徑0.2～0.45μm，所有器皿應清潔和。整個操作過程應在濕盒內進行，以使載網保持濕潤。

二、膠體金標記蛋白A技術（ProteinA-goldtechnique,PAg法）

在電鏡水平應用較為廣泛，因該法具有特異性中、靈敏度高、方法簡便和背景染色淡等優點。蛋白A的免疫特異性在第五章已作了介紹，PAg復合物制備方法簡便，作為第二抗體，無種屬特異性，可以免去不同種屬動物要制備不同的特異性免疫球蛋白。PAg復合物與包埋劑和細胞成分都極少發生非特異性的交互作用，蛋白A和金粒間非共價的結合特性既不影響蛋白A的活性，又能保持高度的穩定性，PAg復合物分子zui小易于穿透組織。

1、蛋白A-金（PAg）復合物的制備（Slot和Geuze,1981）

（1）膠體金液的制備，應用枸椽酸三鈉還原法（見第五章）。

（2）待標記蛋白質和金溶液的準備，同前。注意點是用0.2mol/lK2CO3將金溶液pH調至5.9～6.2之間。

（3）確定膠體金與蛋白A的結合用量比例。取一系列盛有0.1ml膠體金液的小玻璃管，分別加入不同量的蛋白A，5min后，再各加0.25ml10%的NaCl.如加入的蛋白A濃度不夠，不能穩住金粒，在電解質NaCl的影響下，金粒聚合沉淀，溶液由紅變藍。選擇能防止溶液由紅變藍的zui低濃度的蛋白A的量作為兩者的結合比例。以枸椽酸鈉法制成的膠體金每毫升約需要5μg蛋白A來結合，方能保證其穩定性。

（4）膠體金與蛋白A的結合和純化，依上法測得所需的比例超過10%，即每30ml膠體中加入2mg蛋白A，5min后，加入0.3ml PEG作為穩定劑，然后以15000r/min離心45min（不同方法制備的金離心速度不同），略帶紅色的松散的復合物沉淀即為PAg復合物。小心棄去上清液，加入PBS沖洗，如上，松散的PAg復合物置于PBS溶液中，按0.2mg/ml的比例加入聚乙二醇作為穩定劑，保存于硅化的玻璃器皿中備用，也有主張將上述PAg復合物放入3～6ml 5%甘油—0.05%聚乙二醇—0.02%疊氮鈉混合液中，再離心，棄去無色上清液后，收取管底部濃縮純化的PAg復合物置4℃保存。

據文獻報告，此PAg復合物的原液在4℃可保存達一年之久。

2、電鏡水平的PAg染色法 PAg法在電鏡技術的應用原則是二步標記法，可用于包埋前和包埋后染色。其主要區別于一般膠體金免疫染色在：①須1%卵白蛋白—PBs （pH7.4）或1%卵白蛋白—0.05mol/l Tris緩沖液（pH7.4）來封閉非特異性的結合部位，而不是采用羊或其它的動物的正?？寡?，因為PAg復合物能夠與正常血清組中的Ig結合，從而給出假陽性結果;②在應用*抗血清孵育和PBS沖洗后作第二抗血清即PAg復合物孵育前的準備時，應用的PBS或TBS的pH應變更為pH7.4.在變更這兩步后，其它可參照本節 中包埋前、后染色法進行。也可采用下列步驟進行包埋后染色。

（1）載有超薄片的鎳網或金網浮于1%卵白蛋白—PBS液滴上，室溫約5min.

（2）載網不沖洗，直接移至*抗血清液滴上，在室溫孵育2h或4℃18～24h.

（3）PBS沖洗3min×2次。

（4）將PAg原液稀釋10～20倍，載網浮于該液滴上，室溫孵育1h.

（5）PBS沖洗5min×2次。

（6）5%醋酸鈾水溶液染色，水洗。

（7）枸椽柄鉛染色。

（8）電鏡觀察。

三、膠體金雙標記技術（常用為蛋白A—膠體金）

1、單面法以不同直徑的金粒分別標記兩種不同的抗體，以間接法先染*種抗體，洗凈后再染第二抗體。

2、雙面法以不同直徑的金粒標記的抗體于鎳網的兩面分另進行免疫染色。本法的優點是可防止兩種金標記的抗體的相互干擾，又可防止*次應用的一抗與其相應的抗原相結合，占據了空間，第二次應用的抗體沒有適合的空間使之與相應的抗原相結合。

3、異種動物抗原—抗體染色法如一抗分別用人與兔抗血清，人抗組織抗原A，兔抗組織抗原B.第二抗體分別以不同直徑金粒標記的抗人和兔免疫球蛋白。由于種屬不同，兩種抗血清不會互相干擾，在應用一抗和二抗時都可將兩種血清一次混合使用，將四步減少為兩步。

4、金標記抗原檢查法（Gold—labelled antigen detection method, GLAD 法）此法是Larson（1977）年首先提出的，應用放射性同位素如125I或酶標記抗原進行染色。先用特異性抗體與組織抗原反應，標記的純抗原又與特異性抗體反應。Larson（1980，1981）又在此基礎上提出應用膠體金在電鏡水平進行雙抗原甚至多抗原定位。GLAD原理是：雙價的Ig抗體分子過量地加到有抗原的組織切片上，使分子的兩個抗原結合點中有一個結合到組織抗原上，而另一端可與標記金的抗原起反應。雙標記時，預先將兩種不同的抗原標以不同直徑的金粒，可分別與相應的*抗體相結合，從而顯示出兩種抗原在組織切片的定位。此法的優點是標記物所顯示出的組織抗原的部位經過兩次選擇，標記了抗原只能與相應的特異性抗體相結合而不能與切片中非特異性Ig相結合，因此具有較高的特異性。但由于使用此法時需備有與欲檢抗原相同的純抗原，并要對不同抗原分別進行標記，非一般實驗室所能做到，所以至今尚未被廣泛應用。

雙面金標記法操作程序（Cai et al 1993, 改良自Bendayan et al 1982）。

（1）鎳網面A（樹脂包埋）

①蒸餾水沖10min.

②10% H2O2蝕刻10min室溫

③10%正常血清（以0.5mol/l Tris緩沖液pH7.4、含1%BSA和2%Tween20 稀釋，簡稱TBT緩沖液）室溫30min.

④以濾紙吸去多余液體，覆于特異性*抗體1：500（Tris 緩沖液，pH7.4,含1%BSA和0.1%疊氮鈉）4℃，孵育過夜

⑤*清洗，應用0.5mol/L Tris緩沖液pH7.2,不含BSA

⑥繼之用0、5mol/L Tris緩沖液pH7.6,含1%BSA沖洗

⑦0、5mol/L Tris緩沖液pH8.2,含1%BSA，室溫孵15min

⑧羊抗兔IgG標記以15nm金粒，應用0.5mol/l Tris緩沖液pH8.2、含1%BSA稀釋1：40，孵育2h，室溫

⑨0、5mol/L Tris緩沖液pH7.4 沖洗

⑩蒸餾水沖洗

（2）鎳網面B，重復①～⑩，只在第④時更改另一特異性一抗，在⑧時羊抗兔IgG標記以5nm金粒。

（3）鈾鉛雙重染色，電鏡觀察，可見二種不同直徑金粒標記。

注意事項：①所有溶液均須經加有微孔濾紙（0.45μm孔，國內外現均有商品提供）的注射器過濾，過濾后直接以注射器沖洗。②濾紙用無纖維吸水濾紙。③沖洗在膠金標記技術上是個決定性關鍵，僅次于抗體血清的純度。筆者的體會是一般應漂洗3×5min，以注射器噴水漂洗效果優于杯漂洗法，但漂洗水流需與網面平行，勿使水壓破壞切片。

四、免疫電鏡金—銀法染色技術

關于免疫金銀細胞化學的原理、試劑配制和光鏡顯示技術在本書第五章 已作了較詳盡的敘述。免疫金銀細胞化學技術說可應用于電鏡水平。一般用于包埋前染色。其主要操作步驟如下：

（1）組織固定振動切片機切片10～30μm.

（2）人3%正常羊血清，含0.1%Triton X—100 的PBS孵育30min，以封閉非特異性結合部位

（3）1%硼氫化鈉的PBS孵育30min.

（4）一抗37℃，2h.

（5）PBS含0.1%BSA pH7.4 沖洗3min×3次。

（6）PBS含0.1%BSA pH8.2 沖洗3min×3次。

（7）人10～15nm金標羊抗兔抗血清，工作濃度約1：10，37℃孵育45min.

（8）硝酸銀液物理顯影（詳見第五章 第六節 ）。

（9）在解剖顯微鏡下取免疫反應陽性部位，人1%鋨酸后固定20min，常規脫水，樹脂包埋。

（10）超薄切片機切0.1μm左右半薄切片，定位陽性反應部位，制超薄切片。如有暗視野微鏡則更有助于定位。在暗視野前景下，金銀粒呈金黃色閃光顆粒，即使微量金銀也可定位，微鏡則更有助于定位。在暗視野前景下，金銀粒呈金黃色閃光顆粒，即使微量金銀也可定位。

（11）鈾—鉛電鏡染色，電鏡觀察。

免疫金銀法敏感度高，金銀顆粒電子密度高，反差強;應用包埋前染色可先定位陽性反應部位再作電鏡超薄切片，獲得陽性反應機率高，特別適用于含微量抗原的部位，如突觸等。其不足是須經暗室顯影，手續較煩雜，包埋前免疫染色易增加非特異性染色。另外，由于單個金粒周圍結合的銀粒不是固定的，受多種因素影響。因此，電鏡免疫金粒染色法的金粒銀粒計算不適于做半定量觀察，誤差較大。