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豬流感H3N2酶聯(lián)免疫分析（ELISA） 試劑盒使用說(shuō)明書
點(diǎn)擊次數(shù)：1339 發(fā)布時(shí)間：2012-9-27
豬流感H3N2酶聯(lián)免疫分析（ELISA） 試劑盒使用說(shuō)明書 本試劑僅供研究使用 目的：本試劑盒用于測(cè)定豬血清，血漿及相關(guān)液體樣本中流感H3N2的表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)原理： 本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法（ELISA）測(cè)定標(biāo)本中豬流感H3N2。用純化的豬流感H3N2抗體包被微孔板，制成固相抗體，可與樣品中豬流感H3N2抗原相結(jié)合，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗體和其他成分后再與HRP標(biāo)記的豬流感H3N2抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），與CUTOFF值相比較，從而判定標(biāo)本中豬流感H3N2的存在與否。 試劑盒組成： 試劑盒組成 48孔配置 96孔配置 保存 說(shuō)明書 1份 1份 封板膜 2片（48） 2片（96） 密封袋 1個(gè) 1個(gè) 酶標(biāo)包被板 1×48 1×96 2 陰性對(duì)照 0.5ml×1瓶 0.5ml×1瓶 2 陽(yáng)性對(duì)照 0.5ml×1瓶 0.5ml×1瓶 2 酶標(biāo)試劑 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2 樣品稀釋液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2 顯色劑A液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2 顯色劑B液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2 終止液 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2 濃縮洗滌液 （20ml×20倍）×1瓶 （20ml×30倍）×1瓶 2 樣本處理及要求： 1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。 2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。 3. 尿液：用無(wú)菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。 4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬(wàn)/ml左右。通過反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。 5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆谩?biāo)本融化后仍然保持2 6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于 7. 不能檢測(cè)含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。 操作步驟： 1. 編號(hào)：將樣品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每板應(yīng)設(shè)陰性對(duì)照2孔、陽(yáng)性對(duì)照2孔、空白對(duì)照1孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同） 2. 加樣：分別在陰、陽(yáng)性對(duì)照孔中加入陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照50μl。然后在待測(cè)樣品孔先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻， 3. 溫育：用封板膜封板后置 4. 配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液加蒸餾水至600ml后備用 5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。 6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。 7. 溫育：操作同3。 8. 洗滌：操作同5。 9. 顯色：每孔先加入顯色劑A 50μl，再加入顯色劑B 50μl，輕輕震蕩混勻， 10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。 11. 測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。 測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。 結(jié)果判定： 試驗(yàn)有效性：陽(yáng)性對(duì)照孔平均值≥1.00; 陰性對(duì)照平均值≤0.15 臨界值（CUT OFF）計(jì)算：臨界值=陰性對(duì)照孔平均值+0.20 陰性判定：樣品OD值< 臨界值（CUT OFF）者為豬流感H3N2陰性 陽(yáng)性判定：樣品OD值≥ 臨界值（CUT OFF）者為豬流感H3N2陽(yáng)性 注意事項(xiàng) 1．操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行，本試劑不同批號(hào)組分不得混用。 2．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。 3．濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。 4． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。 5．底物請(qǐng)避光保存。 6．試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)，使用雙波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)，參考波長(zhǎng)為630nm 7．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。終止液為 保存條件及有效期 1．試劑盒保存：；2 2．有效期：6個(gè)月