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PCR實驗室分區之前如何設計合理的壓差梯度控制措施?

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PCR實驗室 ,  或稱為 PCR擴增實驗室 ,  就是進行聚合酶鏈反應的實驗室場所,廣泛應用于生物學各個領域。例如艾滋病、乙型肝炎、禽疫病、癌基因的檢測和診斷、DNA指紋、個體識別、親子鑒定、法醫物證、動植物檢疫、動物及其衍生產品檢測、動物飼料、化妝品、食品衛生檢測、轉基因作物與轉基因微生物檢測等。
一、工藝要求
1、PCR實驗室 ,  或稱為 PCR擴增實驗室 ,  就是進行聚合酶鏈反應的實驗室場所,廣泛應用于生物學各個領域。例如艾滋病、乙型肝炎、禽疫病、癌基因的檢測和診斷、DNA指紋、個體識別、親子鑒定、法醫物證、動植物檢疫、動物及其衍生產品檢測、動物飼料、化妝品、食品衛生檢測、轉基因作物與轉基因微生物檢測等。該區域主要完成試劑和主反應混合液的儲存、配制和封裝工作 。所有運送到該區域的試劑和材料不應經過其他區域,試劑和原材料應在本區內儲存和制備。本區域的氣壓應相對外界保持正壓。由于該區域有多種試劑,“安全" 應是平面設計首要考慮因素。平面設計時應保持通風流暢 、逃生暢通。首先實驗臺布置在房間的兩側,中間的過道全部通向走廊便于疏散。同時根據國際人體工程學的標準,實驗臺與實驗臺通道設計為 1500mm,中間的通道可滿足兩邊坐人中間過人的要求。
2、標本制備區
該區域的功能是樣本的保存 、核酸提取和貯存 、樣本加入擴增反應管和測定DNA 的合成 。樣本應直接運送至該區并儲存在本區內,不得經過其他區域。對于氣流壓力的控制,由于在本區內加樣操作可能產生氣溶膠,為避免氣溶膠擴散出去對外界造成污染,本區應對外界保持負壓。從質量控制的角度而言,本區相對于擴增反應混合物配制和擴增區以及擴增產物分析區為正壓,以避免從鄰近區進入本區的氣溶膠污染。但當涉病原微生物時,標本制備區GB 19489-2008《實驗室生物安全通用安全》對BSL-2實驗室的各項安全要求,此時要本區相對于擴增區為負壓,故涉及病原微生物操作時 ,  在綜合考慮質量控制、生物安全因素的前提下,整體上標本制備區與擴增區的壓力應持平。即均為負壓,兩個相鄰房間之間的負壓值基本相當。
3、擴增區
該區域的功能是DNA擴增和擴增片段的測定。此外反應混合液  (來自試劑貯存和制備區)  制備成反應混合液和已制備的DNA模板  (來自標本制備區)  的加入等也可在本區內進行。對于氣流壓力的控制, 相對于鄰近區域為負壓,以避免氣溶膠從本區漏出。為避免氣溶膠所致的污染,應盡量減少在本區內不必要的走動。個別操作如加樣等應在超凈臺內進行。
4、產物分析區
該區域的功能是擴增產物的分析。該區域可能會用到某些可致基因突變的有毒物質,應特別注意實驗人員的安全防護。對于對于氣流壓力的控制,該區域是PCR實驗的最后一 步,壓力應為zui低,相對于鄰近區域為負負壓,以避免氣溶膠從本區漏出。為避免氣溶膠所致的污染,應盡量減少在本區內不必要的走動。
二、平面布局
1、功能分區要求
PCR實驗室原則上分為試劑準備區、樣品制備區、擴增區和擴增產物分析區四個工作區域, 各工作區域應設緩沖間,工作區與緩沖間宜安裝連鎖裝置。不同功能的工作區應是分隔獨立的,各工作區有明顯的標志,不能直通,如果緊密相連,需安裝物品傳遞窗。
前兩區為擴增前,后兩區為擴增后區,擴增前區與擴增后區應嚴格分開。
實驗材料 、試劑、記錄紙、筆、清潔材料等,只能從擴增前區流向擴增后區,即從試劑準備區、樣品制備區、擴增區輸送到擴展產物分析區,不得逆向流動。實驗室的氣流也應從擴增前區流向擴增后區,不得逆向流動。
試劑準備區 、擴增區 、擴增產物分析區,空間可以相對小一些。
樣品制備區要放置生物安全柜和低溫冰箱,空間應大一些。通常每間面積為15~20m2 ,  整個區域面積為60~80m2 。
PCR實驗室區域的設置并不是一成不變的 ,  以下幾種情況需要說明:
(1)  如果樣本在擴增之前需要粉碎處理 ,  則需要增加一個區域用于樣品的粉碎。
(2)  如果采用實時熒光PCR法,則擴增區和分析區可以合并為一個區。
(3)  如果采用全自動化PCR分析儀,則標本制備區、擴增區和分析區可以合并為一個區。
2、緩沖間的設置
影響空氣在不同區域之間傳播污染的主要因素包括壓差、溫差以及門的卷吸作用和人的裹帶作用。壓差是空氣從高壓一側通過門窗縫隙流向低壓一側時的阻力,其隔離作用限制于房間的門、窗等開口處于關閉狀態時候,一旦門打開,兩個房間之間的壓差將瞬間降低為零。因此壓差屬于靜態隔離的一種措施,在開門狀態下起不到隔離作用。門開啟時, 由于溫差、門的卷吸作用和人的裹帶作用 ,  會引起短時間、大風量的室內外空氣交換,產生交叉污染。
由以上分析可知,實驗室門開啟時,必然會產生實驗室內空氣的外泄。因此,對于PCR實驗室,分區之前應分別設置獨立的緩沖間,保證緩沖間的門不同時開啟。同時可進一步設計合理的壓差梯度控制措施進行全過程的“動態隔離 "。在建筑設施上,緩沖間是阻隔室內外空氣流通即交叉污染的首要措施。因此 , 各工作區均需設置緩沖間。

 


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