白介素8受體（可溶性）ELISA KIT

白介素8受體（可溶性）ELISA KIT介紹

白介素 8（IL-8），又稱趨化因子 CXCL8，是一種由單核 - 巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞等分泌的細(xì)胞因子，分子量約 8kd。多種細(xì)胞在 LPS、TNF 或 IL-1 刺激下均可產(chǎn)生 IL-8 。IL-8 通過結(jié)合趨化因子受體白細(xì)胞介素 - 8 受體 α（IL8-Rα，CXCR1）和白細(xì)胞介素 - 8 受體 β（IL-8Rβ，CXCR2），對中性粒細(xì)胞發(fā)揮趨化和激活作用，參與中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的組織損傷，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng) 。在自身免疫性疾病、慢性炎癥性疾病等病癥中，IL-8 產(chǎn)生異常，因此定量檢測 IL-8 對于研究疾病發(fā)生發(fā)展及指導(dǎo)治療意義重大 。而白介素 8 受體（可溶性）ELISA KIT 正是用于精準(zhǔn)檢測相關(guān)樣本中可溶性白介素 8 受體含量的工具 。

一、檢測原理

二、試劑盒組成

1. 酶聯(lián)板：已預(yù)包被抗人白介素 8 受體（可溶性）抗體，一般為 96 孔或 48 孔，用于承載樣本和試劑反應(yīng) 。

2. 標(biāo)準(zhǔn)品：通常為凍干品，有 2 瓶 。臨用前需用樣品稀釋液溶解并稀釋至特定濃度（如高濃度標(biāo)準(zhǔn)品可能為 1600pg/mL），再進(jìn)行系列倍比稀釋，得到不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，如 800pg/mL、400pg/mL、200pg/mL、100pg/mL、50pg/mL、25pg/mL 等，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 。

3. 樣品稀釋液：用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品以及稀釋濃度過高的待測樣本，一般為 1×20mL 裝 。

4. 生wu素標(biāo)記抗體：與可溶性白介素 8 受體特異性結(jié)合，為濃縮液，使用時需用生wu素標(biāo)記抗體稀釋液按比例稀釋，一般為 1×120μL / 瓶（1：100） 。

5. 生wu素標(biāo)記抗體稀釋液：1×10mL 裝，用于稀釋生wu素標(biāo)記抗體 。

6. HRP 偶聯(lián)的親和素：與生wu素標(biāo)記抗體結(jié)合，形成完整的檢測體系，為濃縮液，使用時需用辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液按比例稀釋，一般為 1×120μL / 瓶（1：100） 。

7. 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液：1×10mL 裝，用于稀釋 HRP 偶聯(lián)的親和素 。

8. 底物溶液（TMB）：1×10mL 裝，與 HRP 發(fā)生顯色反應(yīng)，在 HRP 催化下 TMB 由無色變?yōu)樗{(lán)色 。

9. 濃洗滌液：1×20mL 裝，使用時需用蒸餾水或去離子水按一定比例（如 1：25）稀釋，用于洗滌酶聯(lián)板，去除未結(jié)合的物質(zhì)，降低背景干擾 。

10. 終止液：1×10mL 裝，一般為 2N 的硫酸溶液，用于終止顯色反應(yīng)，使藍(lán)色反應(yīng)液轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色 。

11. 覆膜：多為 5 張，用于在溫育過程中覆蓋酶聯(lián)板，防止液體蒸發(fā)和外界污染 。

12. 使用說明書：1 份，詳細(xì)介紹試劑盒的使用方法、注意事項、性能指標(biāo)等 。

三、樣本要求

1. 血清：采集全血后，室溫放置 2 小時或 4°C 過夜，隨后以 1000×g 離心 20 分鐘，小心吸取上清液用于檢測 。收集血液應(yīng)使用一次性無熱原、無內(nèi)毒素的試管 。

2. 血漿：可選用乙二胺四乙酸（EDTA）或肝素作為抗凝劑 。標(biāo)本采集后，需在 30 分鐘內(nèi)于 2 - 8°C 以 1000×g 離心 15 分鐘，取上清備用 。

3. 組織勻漿：先用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS，0.01M，pH = 7.4）沖洗組織，che底去除殘留血液（因勻漿中裂解的紅細(xì)胞會干擾測量） 。稱取適量組織并剪碎，按照約 1：9 的重量體積比（如 1g 組織對應(yīng) 9mL PBS，可按需調(diào)整并記錄），將剪碎組織與 PBS 加入玻璃勻漿器，在冰上充分研磨 。為進(jìn)一步裂解細(xì)胞，可對勻漿液超聲破碎或反復(fù)凍融 。最后，將勻漿液以 5000×g 離心 5 - 10 分鐘，取上清用于檢測 。

4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：將細(xì)胞培養(yǎng)上清以 1000×g 離心 20 分鐘，去除雜質(zhì)及細(xì)胞碎片，取上清即可用于檢測 。

5. 其他生物標(biāo)本：如腦脊液、腹水等，一般以 1000×g 離心 20 分鐘，取上清進(jìn)行檢測 。

四、操作流程

1. 準(zhǔn)備工作：從冰箱取出試劑盒，提前 30 分鐘平衡至室溫，確保所有試劑溫度與室溫一致 。同時，將濃縮洗滌液按要求比例用蒸餾水或去離子水稀釋備用 。

2. 加樣：設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和待測樣品孔 。空白孔加入 100μL 樣品稀釋液；標(biāo)準(zhǔn)孔分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液 100μL；待測樣品孔加入 100μL 待測樣本 。加樣時，將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，避免產(chǎn)生氣泡，隨后用覆膜蓋住酶聯(lián)板，37°C 溫育 120 分鐘 。

3. 洗滌：溫育結(jié)束后，棄去孔內(nèi)液體，將酶標(biāo)板倒扣在吸水紙上，輕輕拍干 。每孔加入 350μL 洗滌液，浸泡 1 - 2 分鐘后，甩去洗滌液，再次拍干 。重復(fù)洗滌步驟 5 次，確保che底洗去未結(jié)合的物質(zhì) 。

4. 加生wu素標(biāo)記抗體：每孔加入 100μL 稀釋好的生wu素標(biāo)記抗體工作液（臨用前配制），覆膜后 37°C 溫育 60 分鐘 。

5. 再次洗滌：溫育完成后，按上述洗滌方法再次洗滌酶聯(lián)板 5 次 。

6. 加 HRP 偶聯(lián)的親和素：每孔加入 100μL 稀釋好的 HRP 偶聯(lián)的親和素工作液，覆膜后 37°C 溫育 60 分鐘 。

7. 第三次洗滌：重復(fù)洗滌步驟 5 次 。

8. 顯色：每孔加入 90μL 底物溶液（TMB），輕輕混勻，37°C 避光顯色 。顯色時間一般控制在 30 分鐘內(nèi)，期間需密切觀察標(biāo)準(zhǔn)品孔的顏色變化，當(dāng)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前 3 - 4 孔有明顯的梯度藍(lán)色，后 3 - 4 孔梯度不明顯時，即可進(jìn)行下一步 。

9. 終止反應(yīng)：每孔加入 50μL 終止液，輕輕混勻，此時溶液顏色由藍(lán)色立即轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色 。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同，且底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液 。

10. 讀數(shù)：在加終止液后 15 分鐘內(nèi)，用酶標(biāo)儀在 450nm 波長處測量各孔的光密度（OD 值） 。

11. 計算結(jié)果：以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 。可借助專業(yè)的曲線制作軟件（如 Curve Expert 1.3 或 1.4），根據(jù)樣品的 OD 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出相應(yīng)的濃度，再乘以樣品的稀釋倍數(shù)，即為樣品中白介素 8 受體（可溶性）的實(shí)際濃度 。

五、性能指標(biāo)

1. 檢測范圍：不同試劑盒有所差異，常見檢測范圍為 15.6pg/mL - 1000pg/mL 等 。

2. 靈敏度：通常可低至能檢測出 3pg/mL 甚至更低濃度的可溶性白介素 8 受體 。

3. 特異性：試劑盒對白介素 8 受體（可溶性）具有高度特異性，與其他結(jié)構(gòu)類似物幾乎無交叉反應(yīng) 。

4. 重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)（CV）一般小于 10%，板間變異系數(shù)小于 15% 。

5. 準(zhǔn)確性：通過對已知濃度的可溶性白介素 8 受體標(biāo)準(zhǔn)品多次檢測，測量值與理論值的偏差在合理范圍，一般回收率在 80% - 120% 之間 。

六、注意事項

1. 試劑盒從冰箱取出后需平衡至室溫方可使用，使用后應(yīng)立即按要求保存試劑，避免試劑反復(fù)凍融 。

2. 操作過程中應(yīng)使用一次性吸頭，防止交叉污染 。加樣時，確保吸頭垂直且深入孔底，避免液體掛壁或產(chǎn)生氣泡 。

3. 洗滌是關(guān)鍵步驟，洗滌不充分易導(dǎo)致假陽性結(jié)果 。若使用自動洗板機(jī)，需提前熟練掌握其操作方法，并定期校準(zhǔn) 。

4. 底物溶液對光敏感，應(yīng)避光保存，使用過程中避免長時間暴露于光下 。顯色反應(yīng)需在 37°C 避光條件下進(jìn)行，且嚴(yán)格控制顯色時間 。

5. 終止液具有腐蝕性，操作時應(yīng)小心，避免接觸皮膚和眼睛 。若不慎接觸，應(yīng)立即用大量清水沖洗，并及時就醫(yī) 。

6. 建議所有標(biāo)準(zhǔn)品和樣本均做雙份檢測，以提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性 。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高，應(yīng)先進(jìn)行稀釋，再重新測定，計算結(jié)果時需乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù) 。

7. 不同批次的試劑盒內(nèi)試劑不能混用，使用前應(yīng)仔細(xì)核對試劑盒的有效期和批次號 。

8. 該試劑盒僅用于科研用途，不得用于臨床診斷 。