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撫生試劑-ELISA法檢測白細胞介素-4
閱讀:179 發布時間:2014-6-6ELISA法檢測白細胞介素-4
白細胞介素-4(1L-4)是Th2細胞分泌的一類重要細胞因子,可促進巨噬細胞的黏附,介導IgE的產生,在局部炎性細胞浸潤中發揮作用,同時IL-4可使IgE受體表達增強,誘導嗜酸細胞聚集和遷移。
[檢測方法] ELISA法
[方法學原理] 在微孔反應板上包被抗人IL-4單克隆抗體,待測標本和標準品中的IL-4會與抗人IL-4單克隆抗體結合,游離的成分被洗去,同時加入生物素化的抗人IL-4抗體和辣根過氧化物酶標記的親和素。生物素與親和素特異結合,抗人IL-4抗體與結合在單克隆抗體上的人IL-4結合而形成免疫復合物,游離的成分被洗去。加入顯色劑,若反應孑L中有IL-4,HRP會使五色的顯色劑呈現藍色,加終止液變黃色。在波長450nm處測吸光度,IL-4濃度與吸光度成正比,可通過繪制標準曲線求出標本中的IL-4濃度。
[標本準備] 靜脈血2ml,不抗凝。
[試劑]
1.預包被微孔反應板
2.濃縮酶結合物
3.酶結合物稀釋液
4.標準晶和標本稀釋液
5.濃縮生物素化抗體
6.IL-4標準品
7.濃縮洗滌液
8.顯色劑A、B
9.終止液
[儀器] 酶標儀或全自動酶聯免疫檢測儀。
[檢測步驟]
1.在微孔反應板相應孔中分別加入待測樣本、不同濃度標準品100ul,再加生物素化抗體.工作液50ul。
2.振蕩混勻,置20~25℃環境中溫育120min。
3.將孔內液體吸干,用洗滌液充分洗滌5次,干燥。
4.除空白孔外,加入酶結合物工作液100ul。
5.振蕩混勻,置20~25℃環境中溫育30min。
6.將孔內液體吸干,用洗滌液充分洗滌5次,干燥。
7.每孔加入顯色劑A、B各50fA,輕輕振蕩混勻,37℃環境中避光顯色10min。
8.加入終止液50tA后,輕輕振蕩混勻。用酶標儀(450nm波長)測定各孔吸光度,與標準曲線對照,求出IL-4水平。
[正常參考值] 務實驗室可根據檢測方法的不同確立正常參考值范圍。
[注意事項]
1.試劑盒從冷藏環境中取出時應在室溫環境中平衡30min后方可使用,未用完的微孔條用自封袋密封保存。
2.酶標板洗滌時各孔均需加滿洗滌液,防止孔內有游離酶不能洗凈。應設定30—60s的洗滌浸泡時間。
3.滴加試劑前應將滴瓶翻轉數次,使液體混勻。滴加時瓶身應保持垂直,以使滴量準確(注意:勿將試劑滴在孔壁上)。
4.所有樣品和廢棄物都應按傳染源處理。終止液為2mol/L硫酸,使用時應注意安全。
5.每批樣本應同時做標準曲線。
6.若標本OD值在標準曲線測定范圍以外,應適當稀釋后重測。