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   ELISA酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)是一種廣泛應(yīng)用在測(cè)定液體樣本中的蛋白、抗體、或激素的免疫分析技術(shù)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)程序，通常是把蛋白、抗體、或激素等（即抗原）直接或是以捕捉抗體（capture Ab）固定在固相載體上，再加入一級(jí)檢測(cè)抗體（primarydetection Ab），形成一個(gè)抗原抗體的復(fù)合物。如果該抗體已經(jīng)用酶（enzyme）標(biāo)記了，即可用來(lái)直接測(cè)定抗原的量，若無(wú)，則可利用另一個(gè)酶標(biāo)記的二級(jí)抗體來(lái)測(cè)定抗原的量。測(cè)定抗原量的方法是加入該酶的底質(zhì)（substrate），作用后產(chǎn)生出現(xiàn)的顏色深淺和樣本中的抗原量呈正比的關(guān)系，依此原理計(jì)算出樣本中的抗原總量或濃度。ELISA生物試驗(yàn)是一種敏感性高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好的實(shí)驗(yàn)診斷方法。
ELISA的主要原理：
1、包被 抗原或者抗體能以物理性吸附于固相載體表面，可能原理是蛋白質(zhì)和聚苯C2H4表面間的疏水性部分相互吸附，吸附之后能保持抗原抗體反應(yīng)等免疫活性；
2、標(biāo)記 抗原或者抗體可通過(guò)共價(jià)鍵與酶連接成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫活性和酶的催化特點(diǎn)；
3、顯色 酶結(jié)合物與相應(yīng)包被在固相載體的抗原或者抗體結(jié)合后，也被固定在固相載體上，加入酶的底物之后可出現(xiàn)顯色反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)的顏色深淺可計(jì)算抗原或者抗體的相對(duì)含量。


一、ELISA雙抗夾心法
雙抗夾心法針對(duì)至少2個(gè)抗原決定簇的多價(jià)抗原。首先介紹一下抗原決定簇，抗原決定簇就是決定抗原性的特殊化學(xué)基團(tuán)，也叫抗原表位，理論上一個(gè)抗原決定簇能誘導(dǎo)產(chǎn)生一種單克隆抗體（可能有童鞋又要問(wèn)單克隆抗體是神馬東東了，以后介紹啊）。由6－12氨基酸或碳水基團(tuán)組成，它可以是由連續(xù)序列（線性表位）組成或由不連續(xù)的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)（構(gòu)象表位）組成。臨床上具有2個(gè)抗原決定簇的多價(jià)抗原有很多，比較常見(jiàn)有HBsAg、AFP、HCG等大分子抗原。檢測(cè)步驟也簡(jiǎn)單，就是包被、洗滌、加樣、洗滌、加樣、洗滌、顯色。具體說(shuō)來(lái)是先將純化的相應(yīng)抗體包被在固相載體上，再加入待測(cè)樣品，若其中含有待測(cè)抗原就會(huì)與固相抗體結(jié)合，洗掉雜質(zhì)后，再加入酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體進(jìn)行反應(yīng)，洗掉多于的酶標(biāo)抗體后，加入底物顯色，顯色與否以及顏色的深淺就代表了待測(cè)抗原是否存在以及相對(duì)含量了。

對(duì)于雙抗夾心法檢測(cè)大分子抗原要注意幾點(diǎn)：
1.固相抗體和酶標(biāo)檢測(cè)抗體一定是分別針對(duì)待測(cè)抗原的兩個(gè)不同抗原決定簇，不然兩個(gè)抗體就會(huì)為爭(zhēng)同一個(gè)決定簇而打架，會(huì)出現(xiàn)假陰性的不良結(jié)果；
2.如果檢測(cè)的樣本是血清，就要注意風(fēng)濕病患者體內(nèi)內(nèi)風(fēng)濕因子RF這種奇葩異種抗體的存在，它能夠神奇地結(jié)合固相抗體和檢測(cè)抗體，造成假陽(yáng)性的不良結(jié)果；
3.包被的固相抗體含量一定是高于樣品中的抗原含量，不然檢測(cè)到的含量會(huì)比實(shí)際含量低；

4.如果想省事一些，將待測(cè)樣品與酶標(biāo)檢測(cè)抗體同時(shí)加入固相載體，在酶標(biāo)檢測(cè)抗體高于樣品中的待測(cè)抗原的情況下，會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果，這種現(xiàn)象書本叫鉤狀效應(yīng)。
 

競(jìng)爭(zhēng)法針對(duì)小分子抗原。這種方法也可以用于大分子抗原，只是相對(duì)雙抗夾心法這種強(qiáng)悍的策略，競(jìng)爭(zhēng)法全沒(méi)有優(yōu)勢(shì)，所以競(jìng)爭(zhēng)法只在檢測(cè)小分子這個(gè)邊緣地帶發(fā)揮余熱了。臨床上主要用于T3、T4、孕酮等激素以及藥物等。檢測(cè)步驟與雙抗夾心法更簡(jiǎn)單，包被、洗滌、加樣、洗滌、顯色，少了一步加樣的過(guò)程，但是設(shè)計(jì)上復(fù)雜一些，首先將純化的相應(yīng)抗體包被在固相載體上，然后每組樣本需要分兩組，一組同時(shí)加入事先混勻好的酶標(biāo)檢測(cè)抗原和樣本的混合物，一組只加入酶標(biāo)記抗原，兩組顏色只差便是待測(cè)抗原的含量。

對(duì)于競(jìng)爭(zhēng)法也需要注意一點(diǎn)，酶標(biāo)記抗原和待測(cè)樣本一定要事先混勻好，然后同時(shí)加入固相載體，不然會(huì)造成bu公平競(jìng)爭(zhēng)，檢測(cè)出現(xiàn)偏差。

利用干擾實(shí)驗(yàn)即可辨別ELISA試劑盒是否檢測(cè)目的抗原，方法如下：
1、將針對(duì)試劑盒特異性的重組蛋白抗原和試劑盒中的檢測(cè)抗體配置成antibody: antigen≈1:2的混合孵育液；
2、37℃孵育15分鐘后，代替原試劑盒中的檢測(cè)抗體；
3、后續(xù)操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，加檢測(cè)抗體、酶復(fù)合物和底物
4、實(shí)驗(yàn)完畢后，檢測(cè)其標(biāo)準(zhǔn)曲線，如果標(biāo)準(zhǔn)曲線良好則說(shuō)明加入的目的抗原和試劑盒抗體不匹配，試劑盒檢測(cè)抗體針對(duì)的是非目的抗原，該試劑盒為偽劣假造elisa試劑盒。
5、如果標(biāo)準(zhǔn)曲線無(wú)線性，則說(shuō)明試劑盒檢測(cè)抗體已被目的抗原中和或干擾，影響了其實(shí)際試劑盒抗體的檢測(cè)作用，則該試劑盒檢測(cè)抗體針對(duì)的是目的抗原。