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實時熒光定量PCR技術實驗準備與步驟
閱讀：201 發布時間：2024-7-22 實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。PCR實驗是分子生物學中常見用的實驗之一，在基因擴增、核酸檢測、基因檢測等方面廣泛應用。
一、PCR實驗前的準備:
在開始PCR實驗之前，必須準備好DNA模板（基因組DNA或逆轉錄制備的cDNA）、特異性引物（自己設計或用軟件設計），并選擇合適的商業酶（選擇符合您實驗目的的酶)
2、引物的特異性影響 PCR 成功的概率，良好的引物設計對 PCR 擴增的成功至關重要。當您開始設計引物時，應仔細考慮以下幾個原則：
①引物的長度。PCR引物一般在18-22bp左右。這對于引物特異性和在退火溫度下的結合來說是足夠長的。
②熔化溫度(Tm)。Tm 定義為在此溫度下，DNA 雙鏈體的一半將解離成單鏈 DNA。52-58C 范圍內的引物 Tm 是最佳的。
③GC 含量。最佳 GC 含量應為 40-60%。
④許多軟件可用于引物設計，例如primer5和Oligo。這些軟件推薦的引物通常可以滿足我們的需求。
二、PCR實驗步驟方法如下：
根據PCR使用說明進行試劑混合預配，并設置 PCR 循環。簡而言之，PCR需要經過以下循環：
1、初始化步驟
這僅對熱啟動 PCR 必須的。此步驟將溶液加熱至 94-98°C，以激活 DNA 聚合酶。該步驟的時間取決于所使用的聚合酶。
2、變性步驟
DNA是雙鏈分子，DNA擴增需要引物與單鏈DNA模板相互作用。在此步驟中，將反應混合物加熱至 94-98°C 并保持 20-30 秒，以破壞兩條鏈之間的氫鍵并生成單鏈 DNA 分子。此時進入 PCR 循環。
3、退火步驟
變性后，反應混合物中的 DNA 模板是單鏈的。由于引物與DNA模板互補，當反應溫度降低到50-65℃時，引物會與模板序列匹配，互補堿基之間形成氫鍵。退火溫度取決于所用引物的Tm，一般比引物Tm低3-5℃左右。該步驟將持續約 20-40 秒以全退火，然后聚合酶將定位到引物-模板雜交體以開始 DNA 組裝。
4、伸長步驟
在此步驟中，DNA 聚合酶開始合成 DNA，因此溫度應為 DNA 聚合酶的最適溫度。一般選擇 72°C，但有些酶在 68°C 時效果更好。這一步與體內DNA復制非常相似，DNA聚合酶將dNTPs添加到引物中，以5'到3'方向與模板互補，最終產生新的雙鏈DNA片段。延伸時間取決于目標 DNA 片段的長度和 DNA 聚合酶的能力。一般來說，DNA 聚合酶每 60 秒產生一千個堿基。
5、2~4步稱為一個循環，每循環一次，目標片段量翻倍。一個 PCR 過程使用 30-35 個循環。在 PCR 循環的早期，PCR 產物以指數速率積累，而在 PCR 循環的后期，隨著 dNTPs、引物的減少和 DNA 聚合酶在變性溫度下的失活，反應減慢，PCR 速率逐漸下降。
6、最終伸長率。
30-35個循環結束后，在68-74℃的溫度下最終延伸約5-10分鐘，以充分延伸剩余的單鏈DNA。
7、貯存。
最終產品可以在 PCR 機器中維持溫度在 4-10℃。