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蛋白質(zhì)定量分析實(shí)驗(yàn)詳解
閱讀：522 發(fā)布時(shí)間：2023-9-22蛋白質(zhì)的定量分析主要依靠蛋白質(zhì)本身的發(fā)色基團(tuán)，或與其它顯色劑反應(yīng)產(chǎn)生的紫外吸收來進(jìn)行的。目前常用的蛋白質(zhì)的定量主要有紫外線吸收法、Bradford法及BCA法等。
實(shí)驗(yàn)原理：BCA（bicinchoninic acid，二辛可酸）法測定蛋白的原理 二價(jià)銅離子在堿性條件下可以被蛋白質(zhì)還原成一價(jià)銅離子（biuret reaction），一價(jià)銅離子和du特的BCA溶液A（含有BCA）相互作用產(chǎn)生敏感的顏色反應(yīng)。兩分子的BCA螯合一個(gè)銅離子，形成紫色的反應(yīng)復(fù)合物。該水溶性的復(fù)合物在562nm處顯示強(qiáng)烈的吸光性，吸光度和蛋白濃度在廣泛范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，并于標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，因此根據(jù)吸光值可以推算出蛋白濃度。
實(shí)驗(yàn)材料：
1.試劑A 含1%BCA二鈉鹽溶液、2%無水碳酸鈉溶液、0.16%酒石酸鈉溶液、0.4%氫氧化鈉溶液、0.95%碳酸氫鈉溶液，將上述液體混勻后調(diào)PH至11.25。
2.試劑B 4%硫酸銅溶液。
3.BCA工作液 按50體積試劑A加1體積試劑B（50：1），配制適量BCA工作液，充分混勻。
4.蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液
（1）儲(chǔ)存液配制：準(zhǔn)確稱取50mg牛血清白蛋白，溶于10ml蒸餾水或PBS中，即為5mg/ml的蛋白標(biāo)準(zhǔn)液儲(chǔ)存液。
（2）工作液：取儲(chǔ)存液10ul稀釋至100ul，使終濃度為0.5mg/ml。
實(shí)驗(yàn)儀器：
主要儀器酶標(biāo)儀是分光光度計(jì)的另一種形式；光電檢測器將待測標(biāo)本不同而強(qiáng)弱不同的光信號(hào)轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的電信號(hào)，電信號(hào)經(jīng)前置放大、對(duì)數(shù)放大、模數(shù)轉(zhuǎn)換等信號(hào)處理后送入微處理器進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和計(jì)算。
實(shí)驗(yàn)方法：
1、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：參照標(biāo)準(zhǔn)配制蛋白質(zhì)溶液及蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。
2、各孔加入200ul BCA 工作液，37℃培養(yǎng)箱放置15~30min。用酶標(biāo)儀測定A562nm,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白濃度。使用溫箱孵育時(shí)，應(yīng)注意防止因水分蒸發(fā)影響檢測結(jié)果。
注意事項(xiàng)：
1、要考慮樣品中可能會(huì)干擾蛋白質(zhì)定量的因素，以此確定合適的蛋白質(zhì)定量方法。
2、每種蛋白質(zhì)定量方法都有一定的檢測范圍，因此需要估計(jì)蛋白質(zhì)含量并進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂專源_保蛋白質(zhì)含量在檢測范圍內(nèi)，保證定量的準(zhǔn)確性。
3、為了保證定量的準(zhǔn)確性，應(yīng)在每次測定時(shí)繪制新的標(biāo)準(zhǔn)曲線。因?yàn)锽CA法測定時(shí)顏色會(huì)隨著時(shí)間的延長不斷加深，并且顯色反應(yīng)的速度和溫度有關(guān)，所以除非精確控制顯色反應(yīng)的溫度和時(shí)間，否則如需精確測定需要每次都繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
優(yōu)點(diǎn):
1、靈敏度高，最小檢測蛋白量可達(dá)0.5ug，檢測濃度下限達(dá)25ug/ml。
2、速度快，比一般的檢測方法快。且不易受去污劑、尿素等的影響。
3、在20-2000ug/ml濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。
缺點(diǎn)：
1.未具體說明說明曲線的繪制方法：以牛血清白蛋白含量為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)曲線空白為對(duì)照，根據(jù)樣品的吸光值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品的蛋白質(zhì)含量。
2.與熒光蛋白質(zhì)定量等方法相比，屬于化學(xué)呈色法檢測靈敏度不夠。
3.會(huì)受螯合劑、高濃度還原劑的影響。