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單分子熒光成像：外泌體分泌動(dòng)力學(xué)受溫度控制
單分子熒光成像：外泌體分泌動(dòng)力學(xué)受溫度控制
熒光顯微鏡的出現(xiàn)，讓細(xì)胞器的觀察成為可能，而如果要觀察到更細(xì)致的目標(biāo)，則需要做單分子熒光成像，今天我們就來(lái)分享一個(gè)今年用TIRF全內(nèi)反射熒光顯微鏡做的單分子熒光成像研究：外泌體分泌動(dòng)力學(xué)受溫度控制。
·為什么使用TIRF全內(nèi)反射熒光顯微鏡
全內(nèi)反射熒光顯微鏡MF53-TIRF
TIRF全內(nèi)反射熒光顯微鏡是利用光線全反射后形成衰逝波特性，來(lái)實(shí)現(xiàn)薄區(qū)域熒光觀察的光學(xué)儀器，這種顯微鏡相比常規(guī)熒光顯微鏡（寬場(chǎng)熒光），背景熒光顯著更低，可以實(shí)現(xiàn)信噪比更高、細(xì)節(jié)更豐富的熒光成像，尤其適合應(yīng)用于細(xì)胞膜物質(zhì)的動(dòng)態(tài)觀察。
衰逝波①
衰逝波是一種光學(xué)現(xiàn)象，當(dāng)激發(fā)光以特定角度入射時(shí)，會(huì)發(fā)生全反射現(xiàn)象，所有激發(fā)光會(huì)被反射，靠近反射面的樣品面則會(huì)形成一個(gè)深度僅幾百納米，光強(qiáng)呈指數(shù)衰減的激發(fā)光，稱為衰逝波。
普通熒光成像與TIRF成像對(duì)比①
利用衰逝波，TIRF全內(nèi)反射熒光顯微鏡可以將激發(fā)范圍控制在樣品面極薄的區(qū)域，從而避免了傳統(tǒng)熒光顯微鏡焦面以外的熒光激發(fā)形成的模糊光暈，大大提升了信噪比和分辨率。由于衰逝波光強(qiáng)呈指數(shù)衰減，因此最合適的應(yīng)用是細(xì)胞膜相關(guān)研究。
·外泌體分泌動(dòng)力學(xué)受溫度控制
我們來(lái)看一個(gè)論文案例，從中了解TIRF全內(nèi)反射熒光顯微鏡的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)：超高分辨率、動(dòng)態(tài)觀察。
使用CD63-pHluorin可視化pH敏感蛋白
使用CD63-pHluorin可視化外泌體與質(zhì)膜融合過(guò)程。TIRF全內(nèi)反射熒光顯微鏡可以實(shí)現(xiàn)單分
子動(dòng)態(tài)跟蹤觀察，為此需要配備高幀率、高靈敏度的顯微鏡相機(jī)，比如MSH12之類背照式sCMOS科學(xué)相機(jī)。
按成像分析，區(qū)分外泌體不同活動(dòng)方式②
單分子熒光成像研究通常涉及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析等內(nèi)容，往往需要一定的算法設(shè)計(jì)來(lái)自動(dòng)化分析和量化處理，比如本論文使用的就是MATLAB腳本，在github可以下載。
成像分析可靠性驗(yàn)證，排除溶酶體或囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)②
通過(guò)成像分析CD63-pHluorin可視化外泌體與質(zhì)膜融合，排除溶酶體或囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)。
外泌體與質(zhì)膜融合有多種動(dòng)力學(xué)模式②
算法分析，得出外泌體與質(zhì)膜融合有多種動(dòng)力學(xué)模式。
外泌體與質(zhì)膜融合事件受溫度控制②
對(duì)不同動(dòng)力學(xué)模式進(jìn)行分析，顯示外泌體與質(zhì)膜融合事件受溫度控制。
模型驗(yàn)證②
利用模型驗(yàn)證解釋實(shí)驗(yàn)觀察到的動(dòng)力學(xué)。
進(jìn)一步的動(dòng)力學(xué)分析②
外泌體與質(zhì)膜融合前先有對(duì)接。
·結(jié)尾
總體而言，全內(nèi)反射熒光顯微鏡MF53-TIRF是細(xì)胞表面物質(zhì)動(dòng)態(tài)觀察的理想儀器，如固定在蓋玻片或細(xì)胞膜表面上的分子等，在TIRF基礎(chǔ)上明美還有dSTORM超分辨成像方案，有興趣的老師可以跟我們聯(lián)系。
如您對(duì)這篇論文感興趣，或者有興趣獲取論文使用的MATLAB自動(dòng)分析處理腳本，請(qǐng)參考應(yīng)用來(lái)源部分信息②。
引用來(lái)源：
①Fish KN. Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy. Curr Protoc. 2022 Aug;2(8):e517. doi: 10.1002/cpz1.517. PMID: 35972209; PMCID: PMC9522316.
②Mahmood A, et al. Exosome secretion kinetics are controlled by temperature. Biophys J. 2023 Apr 4;122(7):1301-1314. doi: 10.1016/j.bpj.2023.02.025. Epub 2023 Feb 22. PMID: 36814381; PMCID: PMC10111348.