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FISH熒光原位雜交技術與熒光顯微鏡
FISH熒光原位雜交技術與熒光顯微鏡
熒光原位雜交技術（FISH）
熒光原位雜交（Fluorescence In Situ Hybridization，FISH）是臨床病理檢測中廣泛運用的一種分子細胞遺傳學診斷技術，其原理是用熒光染料直接或間接標記的DNA核酸探針與待測樣本中的DNA核酸序列按照堿基互補配對的原則進行雜交，然后通過熒光顯微鏡觀察熒光信號位置、數量等來判斷待測序列的缺失、擴增及易位等情況。
FISH熒光原位雜交原理（來源NIH）
目前這項技術已經廣泛應用于染色體精細結構變異分析、動植物基因組結構研究、人類產前診斷、腫瘤遺傳學、基因組進化研究、病毒感染分析等眾多領域。在臨床中應用較多的有以下幾種：
（1）乳腺癌Her-2/neu基因檢測，乳腺癌細胞中Her-2/neu基因的擴增一般預示著患者預后較差，應用針對該基因異常擴增的靶向治療藥物，能特異性地控制癌細胞的生長，改善病人預后。Her-2/neu擴增是靶向藥物使用的關鍵指標，而檢測Her-2/neu擴增的金標準即為FISH
MC50-S拍攝的兩種Her-2檢測結果（紅多于綠表示擴增，要用藥）
（2）宮頸癌TERC基因檢測，準確區分宮頸細胞高度癌前病變與低度癌前發育異常，靈敏度和特異性超過百分之90；
（3）膀胱癌3、9、7、17號染色體數目異常檢測，使用樣本為尿液，屬于無創性早期診斷；
（4）產前檢測，13、18、21、X、Y染色體數目異常檢測，及時發現異常胎兒并判斷染色體疾病種類；
（5）血液腫瘤檢測，通過FISH檢測特定基因，可準確預測預后及指導臨床個性化治療。
FISH技術本質是對遺傳物質進行檢測，所使用的標本類型可以包括1、遺傳病：外周血、羊水、絨毛、胎兒臍帶血，或羊水和絨毛的間期細胞；2、血液病：外周血或骨髓的染色體或間期細胞；3、實體腫瘤（包括骨髓活檢）。理論上講，任何含有足夠癌細胞或DNA的組織、細胞或體液（如胸水、腹水等）標本都可進行相應的基因狀態檢測。
總體而言，FISH可以檢測100kb左右的異常，遠遠高于明場下核型分析的分辨率，同時由于是原位雜交，可以直接體現異常細胞百分比，對于臨床后期治療有著很強的指導作用，且耗時短，操作簡單，已逐步成為臨床檢測、預后監測、用藥指導等重要的技術手段。
FISH熒光原位雜交的成像挑戰
（1）熒光信號點弱，需要大功率熒光光源激發。由于不適當的包埋、固定或探針本身等因素，需要使用高亮度光源才能對熒光探針進行激發。傳統使用汞燈作為熒光光源，在亮度等方面具有一定的優勢，但同時存在熱損傷、壽命短、需要預熱等待、維護復雜等問題，目前已逐步被大功率LED光源所取代。明美系列大功率LED熒光光源克服汞燈的缺點，光譜覆蓋大部分探針激發波段，同時具有亮度高、低光毒性、低熱損傷、過萬小時壽命、即開即用等特點，是FISH檢測中理想的熒光光源。
（2）容易有背景噪聲干擾，需要高截止性能的濾光片組。在使用高亮度熒光光源情況下，使用長通濾光片或截止性能差（OD截止深度低）的濾光片，會導致背景噪聲比正常情況高，而所需要的探針信號會被淹沒在噪聲中，從而造成假陽性或假陰性結果。明美熒光激發塊" a="">明美熒光激發塊">明美熒光激發塊和研究級熒光顯微鏡使用進口濾光片，根據需要可選擇不同窄帶濾光片或雙通濾光片，可有效消除背景熒光干擾，獲得高信噪比的熒光成像。
進口CHROMA濾光片，具有高透光率和優良的截止性能
（3）不同通道下探針信號疊加的挑戰，包括熒光顯微鏡本身性能及FISH圖像處理軟件功能。
對于熒光顯微鏡需要①具有多熒光通道，例如常規的FISH檢測需要使用DAPI、FITC、TexasRed分別對細胞質、蛋白質（抗體）、細胞骨架進行標記，就要求熒光模塊至少具有三個通道；②機身穩定及調焦機構的精細程度，FISH檢測通常在100倍物鏡下進行，信號點可能在不同的焦面，就需要多次微調焦面以得到全部的信號點，高倍下的操作要求顯微鏡具有良好的剛性及精細的調焦行程，以避免圖像漂移和遺漏信號點。
常用的探針熒光染料
對于軟件需要①能對信號點進行增強及將背景熒光消除，部分探針信號點亮度較弱，需要通過軟件對其進行增強，以避免被背景熒光覆蓋；②單通道下的圖像疊加，信號點可能位于不同焦面，需獲得多張圖像進行疊加合成以得到該通道下目標區域全部的信號點；③多通道的圖像疊加，得到的FISH結果是需要對不同探針的位置、數量等情況進行統計，需要軟件將不同通道下得到的圖像疊加在一起，需要保證疊加時不漂移，避免信號點錯位、重疊等造成結果失真。
明美研究級熒光顯微鏡配備6孔落射熒光模塊，可按需配置6個激發通道，采用進口主機，機身穩定剛性高，針對FISH圖像處理，明美開發了專業的處理軟件，具有信號增強、背景去除、通道疊加、出具報告等強大功能。
疊加合成圖片
（4）熒光成像要求相機靈敏度高。FISH探針信號往往都是點狀或成簇分布，要求顯微成像相機有較高的靈敏度，同時具有良好的噪聲控制，這樣才能在背景熒光中獲得所需的點狀/簇狀探針信號。明美MC50-S等熒光顯微相機，像元尺寸超過3μm*3μm，具有優良的弱熒光捕獲能力，同時具有超低的讀取噪聲，可保證FISH檢測中獲得良好的熒光成像。
（5）FISH高倍檢測下對物鏡成像性能的要求。FISH檢測對象是遺傳物質上的信號點，通常使用40-100倍物鏡進行成像，需要能分辨出點狀或簇狀的探針信號，尤其是在雙通等情況下，成對信號點之間的距離很小，這對于物鏡的分辨率就提出很高的要求。明美MF43-M采用高品質半復消色差熒光物鏡，具有高透光率與高數值孔徑，成像效果好，分辨率高。
明美方案
（1）完整FISH熒光原位雜交成像，配套FISH分析系統方案
推薦：熒光顯微鏡MF43-M（醫療器械型號）+顯微相機MC50-S/MS23+熒光光源MG-100/MG-120/MG-200
? 配備6孔落射熒光模塊與大功率LED熒光光源，使用方便激發效果好
? 高品質Chroma濾光片，截止深度大，信噪比高，參數可按需配置
? 高性能主機架，熒光透過率高，低雜散光，機身穩定，調焦準確順滑
? 高數值孔徑半復消色差熒光物鏡，熒光信號強，成像清晰
? 高靈敏度與低讀取噪聲熒光顯微相機，弱熒光成像效果好
? 獲醫療器械注冊的專業FISH圖像分析處理軟件，使用方便，功能強大
（2）已有尼康，蔡司，奧林巴斯，徠卡無限遠顯微鏡，升級FISH分析系統
推薦：尼康，蔡司，奧林巴斯，徠卡無限遠顯微鏡 + 明美六孔熒光模塊 + 熒光光源MG-100/MG-120/MG-200 +顯微相機MC50-S/MS23
? 適合尼康，蔡司，奧林巴斯，徠卡無限遠光學顯微鏡升級
? 專業六孔熒光模塊，激發塊可按需選擇，擴展性強
? 方便易用，超長壽命的LED熒光光源
? 高靈敏度的FISH專用顯微鏡相機，搭配專業FISH圖像分析處理軟件
（3）已有尼康，蔡司，奧林巴斯，徠卡熒光顯微鏡，升級LED熒光光源
推薦：MG-100/MG-120/MG-200
? 可匹配尼康，蔡司，奧林巴斯，徠卡主流熒光顯微鏡
? 覆蓋熒光激發光譜，亮度高，激發效果穩定
? 觸屏控制器，操作直觀簡單
? 壽命長，即開即用，維護簡單
? MG-200液冷散熱，提供更接近汞燈的光強，尤其加強G波段
明美是國家高新技術企業，創立至今已20年，專注于顯微鏡以及顯微成像系統產品的研發、生產和銷售，致力于顯微成像領域的自動化、數字化、智能化；明美迄今已為全球10萬+的用戶提供過產品以及服務;明美曾屢獲國家創新基金支持，被廣東省科技廳認定為顯微成像工程技術研究中心。
公司以品質謀發展，以服務為宗旨，連續11年獲守合同重信用企業認證，已通過ISO9001質量管理體系、ISO14001環境管理體系、ISO13485醫療器械質量管理體系和知識產權管理體系認證，擁有二類醫療器械生產資質。
明美總部位于廣州，在全國20余個大中城市均設有服務網點，提供完善的專業服務。
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來源：https://www.mshot.com/article/1850.html