一、蛋白雙向 電泳實(shí)驗(yàn)服務(wù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡介

2D-WB是雙向電泳與傳統(tǒng)western blot結(jié)合而成的一項(xiàng)技術(shù)。一般實(shí)驗(yàn)流程 為抗原蛋白混合物先經(jīng)雙向電泳分離,然后將凝膠蛋白轉(zhuǎn)印至支持膜上，再通過抗體雜交顯色。2D-WB技術(shù)可以檢測到抗原等電點(diǎn)或分子量發(fā)生的微小變化，在蛋白翻譯后修飾的研究中有很好的應(yīng)用;而2D-WB結(jié)合質(zhì)譜鑒定技術(shù)，可以從蛋白混合物中找到免疫原性更強(qiáng)的抗原。

二、蛋白雙向 電泳實(shí)驗(yàn)服務(wù)概述

2D-WB是雙向電泳與傳統(tǒng)western blot結(jié)合而成的一項(xiàng)技術(shù)。一般實(shí)驗(yàn)流程 為抗原蛋白混合物先經(jīng)雙向電泳分離，然后將凝膠蛋白轉(zhuǎn)印至支持膜上，再通過抗體雜交顯色。2D-WB技術(shù)可以檢測到抗原等電點(diǎn)或分子量發(fā)生的微小變化，在蛋白翻譯后修飾的研究中有很好的應(yīng)用;而2D-WB結(jié)合質(zhì)譜鑒定技術(shù)，可以從蛋白混合物中找到免疫原性更強(qiáng)的抗原。

三、服務(wù)內(nèi)容

1、蛋白質(zhì)抽提與定量;

2、雙向電泳;

3、轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育,顯示成像。

四、實(shí)驗(yàn)操作流程

1、第--項(xiàng)電泳(IEF) ,膠條平衡，第二項(xiàng)電泳SDS-APGE.

2、第二項(xiàng)電泳結(jié)束后，取出凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜方法可選擇濕法轉(zhuǎn)移和半干法轉(zhuǎn)移。常用的膜是NC膜和PVDF膜。

3、封閉，5%脫脂奶粉或5% BSA封閉1小時(shí)(室溫)或過夜(4度)。

4、一抗孵育,根據(jù)抗體說明書選擇孵育時(shí)間，常規(guī)的孵育條件是室溫1小時(shí)或4度過夜，一抗孵育后取出膜

TBST洗滌3次，每次5分鐘。

5、二抗孵育:根據(jù)一抗選擇合適的二抗(抗鼠、抗人、抗兔等)，室溫孵育1小時(shí)后取出膜TBST洗滌3次,每次5分鐘。

6、顯影:將A、B底物按比例稀釋混臺均勻后滴在膜上，暗室中將膠片置于膜上,蓋上壓片夾,曝光一定時(shí)間后將膠片放入顯影液中進(jìn)行顯影，直到出現(xiàn)清晰的蛋白質(zhì)條帶，清水漂洗一下后在定影液中定影， 曝光時(shí)間需綜臺考慮蛋白質(zhì)的上樣量，抗體稀釋濃度，抗體孵育時(shí)間等因素。

7、定影后，清洗膠片，晾干，標(biāo)定marker,掃描圖片和2D Western blot圖片分析。

送樣須知，為了保證2D Western blot技術(shù)服務(wù)能順利進(jìn)行,樣品寄送需滿足以下要求:

1、顧客提供:組織、細(xì)胞、蛋白質(zhì)溶液等; 一抗(可交由研謹(jǐn)公司代購)。

2、運(yùn)輸要求:干冰或液氮包裝寄送。

注:樣本應(yīng)避免各類污染和反復(fù)凍融。

五、技術(shù)服務(wù)報(bào)告內(nèi)容

1、蛋白質(zhì)定量結(jié)果及電泳上樣量;

2、原始膠片、電子圖片及圖片分析結(jié)果;

3、2D Western blot完整的實(shí)驗(yàn)報(bào)告，包括實(shí)驗(yàn)步驟、使用儀器和試劑等。

附: 2D Western blot實(shí)驗(yàn)步驟

1、2D Western blot蛋白質(zhì)樣本制備,制備的主要原則是盡可能溶解全部蛋白質(zhì)，破壞蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間的相互作用，避免各類干擾物質(zhì)，樣品制備與IEF兼容等。

2、雙向電泳的主要步驟，第-項(xiàng)電(IEF) ，膠條平衡，第二項(xiàng)電泳SDS-APGE.

3、第二項(xiàng)電泳結(jié)束后，取出凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜方法可選擇濕法轉(zhuǎn)移和半干法轉(zhuǎn)移。常用的膜是NC膜和PVDF膜。

4、封閉， 5%脫脂奶粉或5% BSA封閉1小時(shí)(室溫)或過夜(4度)。

5、-抗孵育,根據(jù)抗體說明書選擇孵育時(shí)間，常規(guī)的孵育條件是室溫1小時(shí)或4度過夜，一 抗孵育后取出膜TBST洗滌3次，每次5分鐘。

6、二抗孵育:根據(jù)-抗選擇合適的二抗(抗鼠、抗人抗兔等)， 室溫孵育1小時(shí)后取出膜TBST洗滌3次，每次5分鐘。

7、顯影:將A、B底物按比例稀釋混合均勻后滴在膜上,暗室中將膠片置于膜上，蓋上壓片夾，曝光一定時(shí)間后將膠片放入顯影液中進(jìn)行顯影，直到出現(xiàn)清晰的蛋白質(zhì)條帶，清水漂洗一下后在定影液中定影， 曝光時(shí)間需綜合考慮蛋白質(zhì)的.上樣量，抗體稀釋濃度，抗體孵育時(shí)間等因素。

8、定影后，清洗膠片，晾干，標(biāo)定marker,掃描圖片和2D Western blot圖片分析。

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