探針合成實驗步驟
探針是- -小段單鏈DNA或者RNA*片段(大約是20到500 bp)， 用于檢測與其互補的核酸序列。雙鏈DNA加熱變性成為單鏈，隨后用放射性同位素(通常用磷-32)、螢光染料或者酶 (如辣根過氧化物酶)標記成為探針。
實驗材料 | 基因 |
試劑、試 劑盒 | 轉錄緩沖液DTT RNA酶抑制劑CTP ATP S-UTP乙酸銨乙醇 |
儀器、耗 材 | 水溶鍋、離心機、培養箱、烘箱 |
實驗步驟 | 1.在一個含SP6. T3或T7啟動子的載體中，插入目的基因。在編碼序列下游酶切使質粒呈線 性。DNAL以酚/氨0仿抽提， 乙醇沉淀，70%乙醇洗后晾干。以無菌水重溶沉淀至1 ug/ul。 2.室溫配置如下反應混合液(總體積20μl) : (1) 4.0 ul 5x轉錄緩)沖液 (2) 0.2 ul 1 mol/ DTT (3) 60 U RNA酶抑制劑 (4) 1.0 ul三種10 mmol/l NTP中的每-種 (5) 1.0 ul 1 ug/ul酶切DNA (6) 10.0μ ζ[35s] UTP (7) 16 U SP6或T7 RNA聚合酶 (8) 37*C溫育30 min,再加16 U聚合酶并于37 °C溫育40 min。 3.在反應混合液中加入: 60 U RNA酶抑制劑，20 μl 10 mg/ml的載體RNA和1.0μl酶1,于37°C溫育10 min以除去摸板。 4.往反應混合液加入以下液體: 0.8 ul 1 mol/l DTT. 63 μul 無菌水和10 μI3 mol/l乙酸鈉，取出1 ul測定其cpm/ul值。 5.加36.4μ7.5 molM的乙酸銨于反應混合液(終濃度2 mol/)加50~100 ug tRNA載體和272ul冷無水乙醇，置干冰上沉淀10 min,以冷70%乙醇洗沉淀，晾干，需要的話可重復此步。以100μl 10 mmol/l DTT重溶DNA沉淀。 6.確定其cpm/μl值， 并計算摻入百分比，核糖核酸探針應于2~3天內使用。 (70%到90%的標記摻入，結果可得70~90 ng標記的RNA) |
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