摘要
定量聚合酶鏈反應（qPCR）分析具有高靈敏度，這是其成功并廣泛應用于科學實驗室的最重要原因之一。然而，包括移液技術在內的許多因素都會對qPCR分析的結果產生影響。PCR Master Mix 通常在qPCR準備期間使用，但可能很難對其進行準確移液。在本研究中，我們測試了在qPCR中使用電動移液器移取Master Mix。研究證明，使用電動移液器搭配低吸附濾芯吸頭或標準濾芯吸頭對Master Mix移液，可獲得良好的精準性，并能確保移液速度及結果的重現性。從而得出結論，在進行基于PCR的分析時，使用電動移液器移取Master Mix確保得到可重復且可靠的結果。
 
 
引言
基于PCR的應用已成為生物制藥工藝、臨床診斷和學術研究的關鍵手段。然而，在執行定量聚合酶鏈反應（qPCR）時，實驗結果的可變性可能是個問題，移液誤差是需要重點關注的變化來源之一。在qPCR準備階段，對Master Mix試劑進行移液具有挑戰性。Master Mix通常由聚合酶、dNTP、MgCl2以及可能含吐溫和甘油成分的緩沖液組成。

本應用說明的目的是測試在PCR分析應用中使用電動移液器移取Master Mix的可靠性。在定量PCR準備階段，使用電動移液器搭配低吸附濾芯吸頭來移取Master Mix，實驗結果（定量循環，Cq）由準確度和精準度（重現性）來進行評價。

 
方法

移液器和移液器吸頭選擇
使用Picus®電動移液器、Safetyspace低吸附濾芯吸頭和濾芯吸頭。Picus®使用多次分液模式。移取Master Mix時，將電動移液器速度參數設置為1。

qPCR準備
qPCR準備階段使用Picus®電動移液器、Safetyspace濾芯吸頭及低吸附濾芯吸頭。Lo-Bind EP管用于DNA樣品制備及Master Mix的制備。制備用于所有測試的PCR Master Mix儲備液使用了MaximaSYBR Green qPCR Master Mix（不含ROX）、大腸桿菌uidA基因引物以及無核酸酶水。

用移液器將八個 15μL 的Master Mix重復樣品移取至PCR板孔中，用于各種測試條件。無模板對照（NTC）樣品不含大腸桿菌基因組DNA，并加入 5μL 無核酸酶水。用類似方法移取 5μL 含有1×106、1×105、1×104、1×103 以及1×102 個拷貝丨反應大腸桿菌gDNA的系列稀釋標準品。

在每個測試孔中有 5μL 含有1×103 個拷貝丨反應的大腸桿菌gDNA。使用Picus® 電動移液器的多次分液功能及低吸附濾芯吸頭以相同的方式將所有DNA樣本添加到PCR管中。使用LightCycler®480 qPCR儀進行qPCR。循環參數如下：在 95°C下預培養 10 分鐘，隨后在 95°C 10 秒、55°C 10 秒、75°C 15 秒，75°C延伸 10 秒，40 次循環。

對標準品、對照品和樣品中的SYBR綠色熒光激發進行定量。使用LightCycler® 480軟件確定定量循環（Cq）值和實際拷貝數，并使用MS Excel分析結果。

數據分析
Cq值的百分比系統誤差（%S）反映了處理Master Mix的儀器系統（移液器和吸頭系統）Cq值的誤差。移液過程中的隨機誤差是結果精準度的測量，反映了實驗中重復樣品之間的差異。Cq值的百分比隨機誤差（%R）反映了結果的重現性，并且可能受到實驗人員移液操作的影響。