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清華大學(xué)Cell子刊發(fā)表CRISPR新文章
2014-10-27 閱讀(545)
來自清華大學(xué)、哈佛醫(yī)學(xué)院和斯坦福大學(xué)等機構(gòu)的研究人員，通過優(yōu)化sgRNA的參數(shù)提高了CRISPR/Cas9系統(tǒng)在果蠅中的特異性和效率。研究結(jié)果發(fā)布在10月23日的《Cell Reports》雜志上。
清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院的倪建泉（Jian-Quan Ni）博士和斯坦福大學(xué)的Jin Billy Li教授是這篇論文的共同通訊作者。倪建泉的主要研究方向包括干細胞增殖與分化機制、細胞信號的調(diào)控與協(xié)同、細胞信號與表觀遺傳學(xué)，以及分子和遺傳工具的研發(fā)。
在過去的幾年里，人們見證了序列特異性的DNA 核酸內(nèi)切酶技術(shù)的驚人發(fā)展，其能夠在模式生物中實現(xiàn)的基因組編輯，為大大提高我們對于發(fā)育生物學(xué)和疾病的理解帶來了希望（延伸閱讀：Nature：CRISPR技術(shù)在癌癥領(lǐng)域大放異彩 ）。就成本、設(shè)計和效率各方面而言，CRISPR/Cas9系統(tǒng)相比于鋅指核酸酶(ZFN)和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALENs)都具有很多的優(yōu)勢。但盡管強大的CRISPR/Cas9系統(tǒng)有著廣泛的用途，它的特異性和效率仍是用戶群共同關(guān)心的兩個問題。
一些哺乳動物細胞研究表明，單導(dǎo)向RNA (single-guide RNA,sgRNA)和基因組DNA之間核苷酸錯配的數(shù)量、位置和分布是影響脫靶效應(yīng)和誘變效率的主要參數(shù)。還有研究證實Cas9和sgRNA的表達水平共同影響了誘變效率和脫靶效應(yīng)。但大多數(shù)的細胞系研究都沒有獨立評估Cas9和sgRNA，一項體內(nèi)研究表明在某一Cas9表達范圍內(nèi)sgRNA參數(shù)是影響特異性和效率的主要因素。
近期，國內(nèi)外的醫(yī)學(xué)研究人員開發(fā)出了用于果蠅的CRISPR/Cas9系統(tǒng)。但還沒有系統(tǒng)研究評估CRISPR/Cas9系統(tǒng)的效率和特異性。人們迫切期望能夠?qū)τ绊慍RISPR/Cas9系統(tǒng)在果蠅中特異性和效率的參數(shù)展開系統(tǒng)性的調(diào)查。
在這篇文章中研究人員發(fā)現(xiàn)，脫靶效應(yīng)并不存在于與sgRNAs有三個或更多核苷酸錯配的基因組DNA區(qū)域。重要的是，他們證實了誘變效率與sgRNA的6個前間區(qū)序列鄰近基序近端核苷酸（protospacer-adjacent motif-proximal nucleotides, PAMPNs）的GC含量之間呈強正相關(guān)。
此外，研究人員證實通過按照他們確定的優(yōu)化濃度注入精心設(shè)計的sgRNA質(zhì)粒，可以在一個步驟中有效生成4個基因的突變。zui終，利用優(yōu)化的參數(shù)他們通過同源介導(dǎo)的修復(fù)(Homology-directed repair, HDR)生成了HP1a的無效等位基因，并獲得了相比以前報告的要顯著高得多的總誘變率。
新研究工作證實了綜合優(yōu)化sgRNA有望大大簡化在果蠅中的CRISPR/Cas9實驗。
