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恒遠告訴大家：WB實驗的常見問題答疑（1）
閱讀：2380 發布時間：2012-7-25
恒遠告訴大家：關于WB實驗的常見問題以及解決方案（1）
上海恒遠生物科技有限公司是一家生物技術企業，主要從事免疫學、分子生物學和常規生化試劑的研發、銷售。并代理銷售Omega、Sigma、R&D、ATCC、HYCLONE等二十多家國外，致力于為廣大高校、科研院所和企事業單位提供*的科研試劑和完善的技術服務，滿足生物化學、分子生物學、細胞生物學、免疫學等生物科技實驗需求。
1、western blot 的優點
答：靈敏，可達ng級，用Ecl顯色法理論上可達pg 級。方便，特異性高。
2、為什么我的細胞提取液中沒有目標蛋白？
答：原因有很多: a） 你的細胞中不表達這種蛋白質，換一種細胞；b） 你的細胞中的蛋白質被降解掉了，你必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性；c） 你的抗體不能識別目標蛋白，多看看說明，看是否有問題。
3、我的細胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，為什么呢？
答： a） 有沉淀可能因為你的蛋白沒有變性*，可以適當提高SDS 濃度，同時將樣品煮沸時間延長， b） 也不排除你的抗原濃度過高，這時再加入適量上樣緩沖液即可。
4、我做的蛋白質分子量很小（10KD），請問怎么做WB？
答：可以選擇0.2μml的膜，同時縮短轉移時間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉移。其他按步驟即可。
5、我的目的帶很弱，怎么加強？
答：可以加大抗原上樣量。這是zui主要的。同時也可以將一抗稀釋比例降低。
6、膠片背景很臟，有什么解決方法？
答：減少抗原上樣量，降低一抗濃度，改變一抗孵育時間，提高牛奶濃度。
7、目標帶是空白，周圍有背景，是為什么？
答：你的一抗濃度較高，二抗上HRP 催化活力太強，同時你的顯色底物處于一個臨界點，反應時間不長，將周圍底物催化完，形成了空白即“反亮現象”。將一抗和二抗濃度降低，或更換新底物。
8、我的膠片是一片空白，是怎么回事？
答：如果能夠排除下面的幾個問題那么問題多半出現在一抗和抗原制備上。
a） 二抗的HRP 活性太強，將底物消耗光；b） ECM底物中H2O2，不穩定，失活；c） ECL底物沒覆蓋到相應位置；d） 二抗失活。
答：靈敏，可達ng級，用Ecl顯色法理論上可達pg 級。方便，特異性高。
2、為什么我的細胞提取液中沒有目標蛋白？
答：原因有很多: a） 你的細胞中不表達這種蛋白質，換一種細胞；b） 你的細胞中的蛋白質被降解掉了，你必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性；c） 你的抗體不能識別目標蛋白，多看看說明，看是否有問題。
3、我的細胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，為什么呢？
答： a） 有沉淀可能因為你的蛋白沒有變性*，可以適當提高SDS 濃度，同時將樣品煮沸時間延長， b） 也不排除你的抗原濃度過高，這時再加入適量上樣緩沖液即可。
4、我做的蛋白質分子量很小（10KD），請問怎么做WB？
答：可以選擇0.2μml的膜，同時縮短轉移時間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉移。其他按步驟即可。
5、我的目的帶很弱，怎么加強？
答：可以加大抗原上樣量。這是zui主要的。同時也可以將一抗稀釋比例降低。
6、膠片背景很臟，有什么解決方法？
答：減少抗原上樣量，降低一抗濃度，改變一抗孵育時間，提高牛奶濃度。
7、目標帶是空白，周圍有背景，是為什么？
答：你的一抗濃度較高，二抗上HRP 催化活力太強，同時你的顯色底物處于一個臨界點，反應時間不長，將周圍底物催化完，形成了空白即“反亮現象”。將一抗和二抗濃度降低，或更換新底物。
8、我的膠片是一片空白，是怎么回事？
答：如果能夠排除下面的幾個問題那么問題多半出現在一抗和抗原制備上。
a） 二抗的HRP 活性太強，將底物消耗光；b） ECM底物中H2O2，不穩定，失活；c） ECL底物沒覆蓋到相應位置；d） 二抗失活。
9、我在顯影液中顯影1分鐘和5分鐘后,底片漆黑一片,是什么原因呢?
答：a） 可能是紅燈造成的, 膠片本來就被曝光了，可以在*黑暗的情況下操作.看是否有改善.；b） 顯影時間過長。
答：a） 可能是紅燈造成的, 膠片本來就被曝光了，可以在*黑暗的情況下操作.看是否有改善.；b） 顯影時間過長。
10、DAB好還是ECM好？
答：DAB 有毒，但是比較靈敏，是HRP zui敏感的底物；ECM結果容易控制，但被催化時靈敏度差一點，但如果達到閥值，就特別靈敏，可以檢測pg 級抗原。要看你實驗的情況
答：DAB 有毒，但是比較靈敏，是HRP zui敏感的底物；ECM結果容易控制，但被催化時靈敏度差一點，但如果達到閥值，就特別靈敏，可以檢測pg 級抗原。要看你實驗的情況
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