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恒遠總結：細胞活性的三種測定方法
閱讀：2893 發布時間：2011-11-30
細胞活性測定方法
細胞活性測定方法有臺盼藍染色法、克隆（集落）形成法、3H放射性同位素摻入法、 MTT法等。其中MTT法以其快速簡便，不需要特殊檢測儀器、無放射性同位素、適合大批量檢測的特點而得到廣泛的應用。但MTT法形成的Formazan 為水不溶性的，需要加有機溶劑溶解，由于在去上清操作時會有可能帶走小部分的Formazan，故有時重復性略差。為了解決這個問題，研究人員又開發了很 多種水溶性的四氮唑鹽類：如XTT、CCK-8（WST-8）等。
現就這三種四氮唑鹽類方法作一個簡單介紹：
1.MTT法
MTT：化學名： 3-（4，5-二甲基噻唑，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍。檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫 氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲臜（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲 ，用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。該方法已廣泛 用于一些生物活性因子的活性檢測、大規模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經濟。
缺點：由于MTT經還原所產生的甲 產物不溶于水，需被溶解后才能檢測。這不僅使工作量增加，也會對實驗結果的準確性產生影響，而且溶解甲 的有機溶劑對 實驗者也有損害。-2）-2
現就這三種四氮唑鹽類方法作一個簡單介紹：
1.MTT法
MTT：化學名： 3-（4，5-二甲基噻唑，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍。檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫 氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲臜（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲 ，用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。該方法已廣泛 用于一些生物活性因子的活性檢測、大規模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經濟。
缺點：由于MTT經還原所產生的甲 產物不溶于水，需被溶解后才能檢測。這不僅使工作量增加，也會對實驗結果的準確性產生影響，而且溶解甲 的有機溶劑對 實驗者也有損害。-2）-2
2.XTT法
XTT：化學名：2,3- bis（2-methoxy-4-nitro-5- sulfophenyl）-5-[（phenylamino）carbonyl]
-2H-tetrazolium hydroxide，作為線粒體脫氫酶的作用底物，被活細胞還原成水溶性的橙黃色甲 產物。當XTT與電子偶合劑（例如 PMS）聯合應用時，其所產生的水溶性的甲 產物的吸光度與活細胞的數量成正比。
優點：1、使用方便，省去了洗滌細胞；2、檢測快速；3、靈敏度高，甚至可以測定較低細胞密度；4、重復性優于MTT。
缺點：XTT水溶液不穩定，需要低溫保存或現配現用。
XTT：化學名：2,3- bis（2-methoxy-4-nitro-5- sulfophenyl）-5-[（phenylamino）carbonyl]
-2H-tetrazolium hydroxide，作為線粒體脫氫酶的作用底物，被活細胞還原成水溶性的橙黃色甲 產物。當XTT與電子偶合劑（例如 PMS）聯合應用時，其所產生的水溶性的甲 產物的吸光度與活細胞的數量成正比。
優點：1、使用方便，省去了洗滌細胞；2、檢測快速；3、靈敏度高，甚至可以測定較低細胞密度；4、重復性優于MTT。
缺點：XTT水溶液不穩定，需要低溫保存或現配現用。
3.CCK-8法或稱WST-8法
CCK-8試劑中含有WST–8：化學名：2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽]，它 在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪 *（1-Methoxy PMS）的作用下被細胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產物 （Formazan）。的甲 物的數量與活細胞的數量成正比。用酶聯免疫檢測儀在450nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。該方法已被 廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規模的抗腫瘤藥物篩選、細胞增殖試驗、細胞毒性試驗以及藥敏試驗等。
優點：1、使用方便，省去了洗滌細胞，不需要放射性同位素和有機溶劑；2、檢測快速；3、靈敏度高，甚至可以測定較低細胞密度；4、重復性優于 MTT；5、對細胞毒性小；6、為1瓶溶液，毋需預制，即開即用。
缺點:1、與MTT相比，CCK-8和XTT的價格比較貴。2、CCK-8試劑的顏色為淡紅色，與含酚紅的培養基顏色接近，不注意的話容易產生漏加或多 加。
CCK-8試劑中含有WST–8：化學名：2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽]，它 在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪 *（1-Methoxy PMS）的作用下被細胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產物 （Formazan）。的甲 物的數量與活細胞的數量成正比。用酶聯免疫檢測儀在450nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。該方法已被 廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規模的抗腫瘤藥物篩選、細胞增殖試驗、細胞毒性試驗以及藥敏試驗等。
優點：1、使用方便，省去了洗滌細胞，不需要放射性同位素和有機溶劑；2、檢測快速；3、靈敏度高，甚至可以測定較低細胞密度；4、重復性優于 MTT；5、對細胞毒性小；6、為1瓶溶液，毋需預制，即開即用。
缺點:1、與MTT相比，CCK-8和XTT的價格比較貴。2、CCK-8試劑的顏色為淡紅色，與含酚紅的培養基顏色接近，不注意的話容易產生漏加或多 加。
三種方法的比較
| | MTT法 | XTT法 | CCK-8法（WST-8法） |
| 甲臜物水溶性 | 難溶性 | 水溶性 | 水溶性 |
| 檢測波長 | 490 nm | 450nm | 450nm |
| 性狀 | 粉末 | 2瓶溶液 | 1瓶溶液 |
| 使用方法 | 配成溶液后使用 | 現配現用 | 毋需預制 |
| 使用有機溶劑 | DMSO或其它溶劑 | — | — |
| 方便性 | + | ++ | +++ |
| 檢測速度 | + | ++ | +++ |
| 重復性 | + | ++ | ++ |
| 穩定性 | ++ | + | ++ |
| 工作量 | --- | -- | - |
| 對細胞毒性 | --- | -- | - |
| 對人體毒性 | --- | - | - |
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