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小細胞之大奧妙
閱讀：2032 發(fā)布時間：2019-5-7有經(jīng)驗和剛剛從事細胞培養(yǎng)工作的人員都應該認真仔細地詢問下細胞提供方提供的建議，提前了解所要培養(yǎng)細胞的詳細資料，準備好細胞所要用到的培養(yǎng)基和相關試劑，雖然所有的貼壁，半貼壁或者懸浮細胞處理方式差不多，但是不同的實驗室培養(yǎng)條件和處理力度還有試劑的批間差這些問題存在，也會導致對細胞處理不當，或者環(huán)境的不適應而造成細胞的死亡。
1.收到細胞，時間要鏡檢：觀察細胞形態(tài)是否正常，對于貼壁細胞則要注意看貼壁情況是否很好，觀察細胞密度，有疑議及時咨提供細胞的技術人員。由于運輸?shù)臅r間或者溫度的變化，很多貼壁細胞在盛滿培養(yǎng)基的瓶子里生長的狀態(tài)和平時會有點不一樣，主要是貼壁牢固問題。比如293T，平時貼壁就不是很牢，在裝滿的培養(yǎng)基瓶子里面，會發(fā)生大片的脫落，細胞聚集在一起，但是細胞生長還是正常的，通過離心收集，加以胰酶的消化，重新打散，又可以正常的貼壁生長。
2.當通過上一步的觀察，細胞初步?jīng)]有任何問題時，進行下一步操作。當收到的細胞密達到80%左右時，則處理如下：棄除瓶中大部分培養(yǎng)基，僅保留5到10mL培養(yǎng)所需的常規(guī)培養(yǎng)基；或更換新鮮的培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中，隨后每天觀察。細胞在低于正常生長溫度情況下，會調(diào)整為靜止期，或者慢速生長期，必須恢復37度的環(huán)境至少3個小時左右，才能重新調(diào)整到接近對數(shù)生長期的狀態(tài)，在對數(shù)生長期進行細胞的傳代會大大增加傳代的成功率，和細胞的存活率。
3.如果經(jīng)步觀察發(fā)現(xiàn)細胞密度超過90%，并且細胞狀態(tài)很好時，則復溫后2個小時需要立即傳代。傳代的比例應依據(jù)不同的細胞而定。對于生長比較快，狀態(tài)穩(wěn)定，不易受外界影響的細胞可以一次多傳幾瓶；對于生長較慢，細胞比較薄，狀態(tài)容易波動的細胞類型，一次少傳些，保證每瓶細胞密度大些，便于穩(wěn)定生長。至于一些比較陌生的細胞，次處理也可以依照第二種情況。
傳代操作：
1.吸除培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。
2.加入無菌pbs洗液（5-8mL）輕輕潤濕細胞，稀釋多余的培養(yǎng)基，之后吸走洗液，動作要輕，不可吹打到細胞。
3.向瓶內(nèi)加入含0.25%EDTA的胰蛋白酶混合液少許，以能覆滿瓶底為限。
4.置溫箱中2~5分鐘，一旦鏡檢發(fā)現(xiàn)細胞質(zhì)回縮，細胞間隙增大后，細胞變圓，比較松動后，立即終止消化。
5.加入該細胞對應的培養(yǎng)基6mL（T25培養(yǎng)瓶）或12mL（T75培養(yǎng)瓶）終止消化。
6.用吸管通過吸取的培養(yǎng)基輕輕反復吹打瓶壁細胞，使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。吹打時應盡量以少的次數(shù)將細胞從壁上吹下，不僅要控制吹打的力度、次數(shù)，還要注意要將細胞盡可能吹成單個。這樣既能減少死細胞，又能便于細胞再次均勻貼壁生長。
7.依據(jù)傳代比例，將細胞懸液分瓶，再補充培養(yǎng)基后，靜置于溫箱培養(yǎng)，直止貼壁。
貼壁細胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，繼續(xù)生長的空間不足，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成份也消耗較多，同時代謝廢物也有較多堆積，需要分瓶培養(yǎng)，對細胞進行傳代擴增。對于貼壁不太緊的細胞如293，可以直接吹散后分瓶。而對于貼壁較緊的細胞如CHO，則需要以胰酶消化后再吹散分瓶。以筆者的經(jīng)驗，以輕吹或加培養(yǎng)液后輕搖可下較好，但對于經(jīng)驗不太充分的實驗者而言是較難判斷掌握的。
胰酶消化的程度是一個關鍵：消化過度則對細胞的活性影響較大，并有部分細胞漂浮，隨棄去的胰酶流失;消化不足則細胞難于從瓶壁上吹下，反復吹打同樣也會損傷細胞活性。影響消化速度的因素較多，主要有胰酶溶液的活性(配制條件、凍存或4℃保存時間長短、是否反復凍融、解凍后存放時間及溫度等)、消化時的溫度(氣溫、細胞培養(yǎng)瓶及胰酶溶液的溫度)以及所加胰酶溶液的多少等。含有EDTA的胰酶會比不含的消化能力強很多，不同細胞對消化液的敏感性也不同，比如HEP-G2人肝癌細胞，該細胞消化時間可長達10分鐘左右。 消化時間仔細去摸索一下，每過2分鐘鏡下觀察細胞是否變圓，記錄*消化時間，下一次操作參考之前的記錄來控制時間即可。
對于懸浮細胞換液時只需要補液就行。
懸浮細胞的傳代則不需要用胰酶消化，直接通過計數(shù)算好傳代的比例，直接分瓶，補液。有些懸浮細胞趨于成團生長，此時細胞生長狀態(tài)良好，當補液時，避免吹打。典型實例：jurkat就是成團生長。當jurkat細胞密度比較大時，可將培養(yǎng)瓶豎直放置2分鐘左右，待大部分細胞沉下，吸走上層清液，補充等量的新鮮培養(yǎng)基。