Thermofisher（Invitrogen）Qubit 4熒光計

尤其適合樣品珍貴、對準確性要求*的應用領域

哪些用戶需要使用Qubit 4 熒光計？

如果您的樣品十分珍貴或用于精密應用領域，或者您為了獲得研究結果進行了巨大的投入，那么Invitrogen™ Qubit™ 4 熒光定量計就是您的理想之選。想想下面這些問題：

— 需要快速檢測RNA 樣本的完整性和質量？ — 我的樣品十分珍貴而且難以處理嗎？

— 提取后的DNA、RNA 或蛋白質量很少嗎？ — 該樣品將被用于成本高昂的下游實驗嗎？

— 我要使用諸如實時定量PCR (qPCR) 或下一代測序方法等需要精密測定的實驗方法嗎？

— 我要進行諸如轉染等需要幾天甚至幾周才能獲得結果的實驗嗎？

— 我的樣品制備過程復雜而且需要諸如激光捕獲顯微切割等特殊技術嗎？

為什么要使用Qubit 4 熒光計？

Qubit 4 熒光計采用專門研制的熒光檢測技術和Invitrogen™ Molecular Probes™ 染料。這些染料熒光只有與特異性的靶分子結合時，才能發射熒光信號，即使有游離核苷酸或降解核酸存在，這些染料仍能發揮作用。Qubit 4 熒光定量即便在低濃度下亦具有目前高的DNA 和RNA 定量特異性和靈敏度。

※ 選擇性 — Qubit 熒光定量( 圖1) 采用Qubit 分析試劑盒( 表1)，其包括的染料，只有與DNA、RNA 或蛋白質結合時方可發出熒光。由于Qubit 技術只報告靶分子( 而不是雜質) 的濃度，因此這種特異性可以使您獲得十分精確的結果

圖1. Qubit 熒光定量系統。

表1. Qubit 分析試劑盒的分析范圍。

※ 靈敏性 — 僅需1 uL 樣品，能精確可靠地定量濃度僅為10pg/_L 的DNA 和12.5μg/mL 的蛋白質樣本

※ 簡單直觀 — 反應靈敏的5.7 英寸彩色觸摸屏，直觀的導航按鈕

※ 迅速 — 全新的雙核處理器，5 秒內快速計算樣品濃度，多存儲1000 個結果

※ 個性化 — 個性化設置常規應用，可通過MyQubit 軟件和網絡工具創建個性化assay，六國操作語言可供選擇

上市12 年來，Qubit 熒光計一直以其*的準確度和靈敏性，受到全球上萬個實驗室的青睞。迄今為止，已經有17,500 篇有關Qubit 的文獻引述。新推出的Qubit 4 熒光計秉承上一代儀器的高準確性，不僅僅可精確測量樣品DNA，RNA 和蛋白質含量，還擁有全新的功能，包括：

※ 適用全新RNA IQ assay — 快速可靠地檢測RNA 完整性和質量

※ 數據導出 — 除U 盤和USB 連接電腦導出數據，還擁有WiFi 功能

※ 內置試劑計算器 — 快速計算配置工作溶液所需的染料和緩沖液

Qubit 熒光定量的工作流程

Qubit 熒光定量采用熒光染料對目標生物分子進行定量

采用Qubit 4 熒光計完成的Qubit 分析均采用同一種通用實驗方案。進行DNA 和RNA 分析只需混合然后讀數，孵育時間僅為2 分鐘，蛋白質分析孵育時間為15 分鐘( 圖2)，查看Qubit 分析的實驗方案。實驗完成，Qubit 4 熒光計會自動保存您的實驗數據，多1000 個。此外，您也可以通過U 盤，USB 數據線或WiFi 導出數據。

將染料和緩沖液置于室溫下儲存，以獲得佳結果。DNA、RNA和蛋白質標準品置于4℃儲存。使用前，確保所有分析試劑均在室溫下。

* 除了常用的 dsDNA, oligos, total RNA, microRNA, RNA IQ 和 protein 分析之外，使用Ion Sphere Quality Control Kit，還可用于檢測Ion Sphere Particle 的質量，以用于Ion PGM 測序儀。

圖2. 采用Qubit 4 熒光計進行Qubit 分析的工作流程。

Qubit 操作簡單直觀

內置試劑計算器。 輸入樣品和標準品的數量，使用此工具可幫助您快速計算配置工作溶液需要的染料和緩沖液。

Qubit 熒光定量與NanoDrop及其它紫外分光光度計定量方法有何不同？

Thermo ScientificTM NanoDropTM 及其它紫外分光光度計均采用紫外吸光度進行檢測，它無法區分出DNA、RNA、降解核酸、游離核苷酸及其它雜質。而Qubit 定量平臺采用熒光染料檢測特異目標分子的濃度。

盡管紫外吸收定量法是的一種DNA 或RNA 定量方，但其讀數并不可靠且不精確(1-4)。紫外吸光度讀數不加區別檢測吸光度為260nm 的所有物質，包括DNA、RNA、蛋白質、降解核酸和游離核苷酸。由于Qubit 4 熒光計只檢測目標分子，因此其讀數一般低于A260 讀數，定量更精確。

此外，分光光度計的靈敏度不足，無法完成低濃度DNA 和RNA的定量。相反，Qubit 4 熒光計能在較低的濃度范圍內得出比采用NanoDrop 分光光度計進行紫外吸收檢測更準確、精密的結果( 圖3)。鑒于上述缺點，使用熒光染料定量核酸已成為一種常見的替代方法[5–8]。

低濃度下的準確度和精度比較

Qubit 熒光定量能在較低的濃度范圍內得出比采用NanoDrop分光光度計進行紫外吸光度檢測更準確、更精密的結果。采用Qubit dsDNA HS 分析試劑盒及Qubit 熒光計，定量濃度僅為10pg/_L 的樣本中的DNA，測得值在實際值的±12% 范圍內( 圖3A)。而采用NanoDrop 分光光度計測量上述相同樣本，測得的濃度比實際值高46 倍。使用Qubit 熒光計檢測低至10 ng/_LDNA 的樣本(NanoDrop 分光光度計的報道下限值為2 ng/_L)，測得值在實際值的±1% 范圍內，使用NanoDrop 分光光度計測定的濃度在實際值的±5% 范圍內。此外，采用Qubit 熒光計檢測DNA 濃度低至0.5 ng/_L 的樣本，所有樣本的重復差異(%CV)均_1% ( 圖3B)。而采用NanoDrop 分光光度計檢測，只有DNA濃度為4ng/_L 及以上的樣本的%CV 低于9%。

圖3. Qubit 熒光定量的準確度和精度。根據標準試劑盒實驗方案，在Qubit 熒光計中采用Qubit dsDNA HS 分析試劑盒重復10 次測量濃度在0.01至10ng/_L 之間的lambda DNA。同時采用NanoDrop ND-1000 分光光度計重復10 次測量相同濃度的DNA，比較結果的準確度(A) 和精度(B)。準確度定義為與已知濃度的平均偏差。標示的濃度是在Qubit 分析管中稀釋前起始樣本的DNA 濃度。

針對DNA 或RNA 的選擇性比較

采用Qubit 熒光定量和紫外吸光度測量核酸濃度的差異在于Qubit 分析的選擇性，Qubit 分析針對目的分子具有*的特異性，可提供較紫外吸光度更準確的信息。采用紫外分析時，同時含有DNA 和RNA 的樣本結果無差別，您無法將它們DNA和RNA 區分開來。而Qubit 熒光定量能夠準確測定同一樣本中的DNA 和RNA ( 圖4)。在本實驗中，樣本含有相同含量的DNA和RNA，采用Qubit dsDNA BR 分析試劑盒測得的DNA 濃度在實際含量的±2% 范圍內。此外，在RNA 含量較DNA 高10倍的樣本中，采用DNA 分析測得的濃度僅比實際值高7%。而采用NanoDrop 分光光度計進行紫外吸光度檢測，無法準確測量上述樣本中的DNA 和RNA 含量，這增加了后續實驗中出錯的可能性。

圖4. Qubit 分析與紫外分光光度法相比具有選擇性。采用Qubit dsDNABR 和Qubit RNA BR 分析試劑盒及Qubit 熒光計，按照試劑盒實驗方案檢測含有lambda DNA (10 ng/uL) 和不同量的大腸桿菌核糖體RNA (0-100 ng/uL) 的樣本，每個樣品重復3 次。然后采用NanoDrop ND-1000分光光度計檢測同一樣本三次，采用PerkinElmer Lambda 35 分光光度計檢測一次。標示的濃度是在Qubit 分析管中稀釋前起始樣本的DNA和RNA 濃度。紅色和橙色趨勢線分別表示起始樣本中DNA 和RNA 的實際含量。( 分別) 稀釋純的濃縮DNA 和RNA 溶液，采用PerkinElmer Lambda 35 分光光度計測定260 nm 處的光密度，使稀釋后溶液的光密度值為1.0，設定核酸的實際濃度。然后計算儲液濃度，用于后續稀釋。采用紫外分析時，同時含有DNA 和RNA 的樣本結果無差別- 您無法將它們區分開來。

靈敏度和范圍比較

采用Qubit 熒光計及Qubit 分析試劑盒的靈敏度高于紫外吸光度檢測，由于該分析能夠檢測1–20uL 的樣本，因此分析的有效范圍進一步擴大。Qubit dsDNA HS 和BR 分析試劑盒覆蓋的樣本濃度范圍為10 pg/uL 至1 ug/uL DNA。據制造商報道，NanoDrop 分光光度計覆蓋的樣本濃度范圍為2 ng/uL 至15 ug/uL，由此可見，Qubit 適合的濃度范圍更寬，不過，高濃度樣本在分光光度計上測定就不必稀釋。

如何創建個性化的分析應用？

熒光計模式

選擇熒光計模式，Qubit 4 熒光計就可以被用做小型的熒光計。在熒光計模式里，不同于使用分析試劑盒時的校準和基于算法的計算結果，儀器直接產生并顯示每個樣本的原始熒光數據(RFU)。熒光計模式允許您可以手動選擇發射光源：藍色LED ( 大~470nm) 或紅色LED ( 大~635 nm)。如果選擇藍光發射，儀器讀取綠色或遠紅外通道的熒光；如果選擇紅光發射，則僅讀取遠紅外通道的熒光。

通過熒光計模式收集的數據可以用于設計您的個性化assay 配合MyQubit 創建新的分析類型。

MyQubit- 為Qubit 4 熒光計設計和創建新的分析類型

Qubit 4 熒光計與MyQubit assay 設計工具兼容。您只需在此在線工具上輸入您的assay 參數，保存并上傳.qbt 文件至您的Qubit 4 熒光計，即可運行您的個性化分析，拓展Qubit 的應用范圍。

* 目前，我們已開發6 個新的分析( 膽guchun、葡萄糖、半乳糖、guan酸、過氧化氫、蔗糖分析)，如有需要可直接下載上傳至您的Qubit。

Thermofisher（Invitrogen）Qubit 4熒光計儀器參數：

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