手性色譜柱的分類和原理

手性色譜柱（Chiral HPLC Columns）是由具有光學活性的單體，固定在硅膠或其它聚合物上制成手性固定相（Chiral Stationary Phases）。通過引入手性環境使對映異構體間呈現物理特征的差異，從而達到光學異構體拆分的目的。要實現手性識別，手性化合物分子與手性固定相之間至少存在三種相互作用。這種相互作用包括氫鍵、偶級-偶級作用、π-π作用、靜電作用、疏水作用或空間作用。手性分離效果是多種相互作用共同作用的結果。這些相互作用通過影響包埋復合物的形成，特殊位點與分析物的鍵合等而改變手性分離結果。由于這種作用力較微弱，因此需要仔細調節、優化流動相和溫度以達到*分離效果。　在手性拆分中，溫度的影響是很顯著的。低溫增加手性識別能力，但可能引起色譜峰變寬而導致分離變差。因此確定手性分析方法過程中要考慮柱溫的影響，確定*柱溫。迄今為止，尚沒有一種類似十八烷基鍵合硅膠（ODS）柱的普遍適用的手性柱。不同化學性質的異構體不得不采用不同類型的手性柱，而市售的手性色譜柱通常價格昂貴，因此如何根據化合物的分子結構選擇適用的是非常重要的。

根據手性固定相和溶劑的相互作用機制，可提出的分類體系：

第1類：通過氫鍵、π-π作用、偶級-偶級作用形成復合物。

第2類：既有類型1中的相互作用，又存在包埋復合物。此類中典型的是由纖維素及其衍生物制成的。

第3類：基于溶劑進入手性空穴形成包埋復合物。這類中zui典型的是環糊精型手性柱，另外冠醚型手性柱和螺旋型聚合物，如聚（苯基甲基甲基丙烯酸酯）形成的也屬于此類。

第4類：基于形成非對映體的金屬絡合物，也稱為手性配位交換色譜（CLEC）。

第5類：蛋白質型。手性分離是基于疏水相互作用和極性相互作用實現。

根據固定相的化學結構，將分為以下幾種：

●　刷（Brush）型或稱為Prikle型

●　纖維素（Cellulose）型

●　環糊精（Cyclodextrin）型

●　大環抗生素（Macrocyclic antibiotics）型

●　蛋白質（Protein）型

●　配位交換（|Ligand exchange）型

●　冠醚（Crown ethers）型

1 刷型：應用范圍較廣、柱效很好的。

刷型是根據三點識別模式設計的，刷型手性固定相分為 π 電子接受型和 π 電子提供型兩類。

zui常見的 π 電子接受型固定相是由（ R ） -N-3 ， 5- 二硝基苯甲酰苯基甘氨酸鍵合到 γ- 氨丙基硅膠上的制成。此類刷型可以分離許多可提供 π 電子的芳香族化合物，或用氯化萘酚等對化合物進行衍生化后進行手性分離。 π 電子供給型固定相常見的是共價結合到硅膠上的萘基氨基酸衍生物，這種固定相要求被分析物具有 π 電子接受基團，例如二硝基苯甲酰基。醇類、羧酸類、胺類等，可以用氯化二硝基苯甲酰、異腈酸鹽、或二硝基苯胺等進行衍生化后，用 π 電子供給型固定相達到手性分離。

刷型固定相的優勢在于其易于合成。另外，刷型固定相具有高的容量因子，因此具有高的選擇因子。它的不利之處在于它僅對芳香族化合物有效，有時不得不進行衍生化反應。這種衍生化反應是非手性衍生反應，所以不存在手性衍生的問題。刷型手性色譜使用的流動相基本是極性弱的有機溶劑，這對于制備色譜來講未必是缺點。

近來，刷型固定相出現了 π 電子供給和接受基因的混合固定相。十分適用于 β- 阻斷劑的手性分離。典型的流動相為二氯甲烷 - 乙醇 - 甲醇混合物，比例為 85 ： 10 ： 5 。加入 10mM 醋酸銨可以調整保留時間。同時具有 π 電子供體區和受體區，形成手性裂縫，因此對于某些分子具有很高選擇性。

2 纖維素型： 
　　纖維素型的分離作用包括相互吸引的作用及形成包埋復合物。它們屬于分類中的第 2 種類型。市售的為微晶三醋酸基、三安息香酸基、三苯基氨基酸鹽纖維素固定相。很多化合物可通過此類型的色譜柱得到分離。這種類型的種類也很齊全。流動相使用低極性溶劑，典型的流動相為乙醇 - 己烷混合物。但特別要注意由于氯可以使纖維素從硅膠上脫落，因此要確保流動相中無含氯溶劑。 
　　這種類型的主要的制造商之一是日本的 Daicel 公司，他們生產的纖維素酯和氨基甲酸纖維素柱可以分離多種生物堿和藥物。特別值得一提的是 OD 柱。在某手性化合物異構體的分離中，分離度超過了 25 ，這意味著載樣量可以很高，對于制備十分有利。纖維素固定相的每個單元都為螺旋型，而且這種螺旋結構還存在極性作用、 π-π 作用及形成包埋復合物等手性分離因素。淀粉代替纖維素制成的此類手性柱顯示了和纖維素柱不同的選擇性，但是穩定性較差。因為淀粉是水溶性的，因此流動相中必須無水才能保證柱子壽命。目前此類型的柱子能分離 80% 左右可能面臨到的所有手性化合物。此類柱子通常用于正相系統，用正己烷 - 乙醇，正己烷 - 異丙醇混合溶劑為流動相。 OD 柱也可用于反相的情況，但流動相必須含有高濃度的高氯酸鹽緩沖液，以防止固定相溶解。即使這樣，使用較長時間以后色譜柱也難免要受到損害，但是在某些情況下使用反相系統分離效果要優于使用正相系統。