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本試劑盒采用雙位點夾心酶聯免疫吸附法（ELISA），測定樣品中小鼠D二聚體（D2D）的水平。向預先包被小鼠D二聚體（D2D）抗體的酶標孔中加入標準品、待測樣本和HRP標記的D二聚體（D2D）抗體，經過溫育和洗滌，去除未結合的組分，然后再加入底物A、B，產生藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺與樣品中小鼠D二聚體（D2D）的濃度呈正相關。

試劑盒組成

1	標準品（2000ng/ml）	0.5ml	7	顯色劑A液	6ml
2	標準品稀釋液	6mL	8	顯色劑B液	6ml
3	酶標包被板	12孔×8條	9	終止液	6ml
4	酶標試劑	6ml	10	說明書	1份
5	20×濃縮洗滌液	25ml	11	封板膜	2張
6	樣品稀釋液	6ml	12	密封袋	1個

注：標準品用標準品稀釋液依次稀釋為：2000、1000、500、250、125、0ng/ml

需要而未提供的試劑和器材

1． 37℃恒溫箱。

2．標準規格酶標儀。

3．精密移液器及一次性吸頭

4．蒸餾水，

5．一次性試管

6．吸水紙

注意事項

1．從2-8℃取出的試劑盒，在開啟試劑盒之前要室溫平衡至少30分鐘。酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。

2．各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差

3．建議所有標準品、樣本都做雙份檢測。

4．嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.

5．為避免交叉污染，要避免重復使用手中的吸頭和封板膜。

6．不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。

7．底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。

洗板方法

手工洗板方法：甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將稀釋后的洗滌液至少0.35ml注入孔內，浸泡1-2分鐘。根據需要，重復此過程數次。

自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中

標本要求

1．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

2．標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融

操作程序

1．分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準品孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品孔中加入標準品50μl；在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）。每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。輕輕晃動混勻，37℃溫育60分鐘。

2．棄去液體，甩干，每孔加滿稀釋后洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。如此重復5次，拍干。

3．每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.

4．取出酶標板，每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。

5．測定：以空白孔調零，在450nm波長下測量各孔的吸光度值（OD值）。測定應在加終止液后15分鐘以內進行。

6．根據標準品的濃度及對應的OD值計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據樣品的OD值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度。也可以使用各種應用軟件來計算。應記住由于樣品稀釋了的，其實際濃度應該乘以總稀釋倍數。

操作程序總結：

準備試劑，樣品和標準品

加入準備好的樣品、標準品和酶標試劑，37℃反應60分鐘