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酵母β－半乳糖苷酶的測(cè)定
點(diǎn)擊次數(shù)：2432 發(fā)布時(shí)間：2012-2-13
1) 粗提取物測(cè)定
1．在適當(dāng)溫度下(通常30℃)，用適當(dāng)培養(yǎng)液將5ml細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)到濃度為1×107～2×107細(xì)胞/ml。如果自主復(fù)制質(zhì)粒的雜合基因表達(dá)，可使用一種適當(dāng)培養(yǎng)基對(duì)存在質(zhì)粒的菌株進(jìn)行篩選。
2．在冰上冷卻細(xì)胞，離心收集。注意：以下步驟保持細(xì)胞在冰上。
3．棄上清液，將細(xì)胞懸浮于250μl裂解緩沖液中，然后置－20℃凍結(jié)，以備的第二天測(cè)定。以下步驟均在1.5ml離心管中進(jìn)行。
裂解緩沖液：
100 mmol/L Tris-HCl (pH8)
1 mmol/L 二硫蘇糖醇
20％ 甘油
4．若細(xì)胞凍結(jié)，可在冰上將其凍結(jié)。加玻珠恰好到液面下，再加12.5μl PMSF母液。
5．以高速振蕩混合6次，每次15秒，間歇時(shí)放在冰上。
6．加入250μl的裂解緩沖液，用1000μl移液器插到離心管底部抽打使其充分混勻。
7．離心15分鐘澄清提取物。如果活性成分存在于顆粒狀碎片中，則可用未澄清的上清液，而測(cè)定的混合物將在步驟8澄清。
8．測(cè)定：
a. 加10～100μl抽提物到0.9ml的Z緩沖液中，用裂解緩沖液定容至1ml。
Z緩沖液：
16.1 g Na2HPO4•7H2O
5.5 g NaH2PO4•H2O
0.75 g KCl</P< p>
0.246 g MgSO4•7H2O
2.7 ml β-巰基乙醇
用蒸餾水定容至1升
調(diào)pH至7.0，保存于4℃
b. 在28℃水浴中將混合物保溫5分鐘。
c. 加入0.2ml臨硝基苯-β-D半乳吡喃糖苷(ONPG)母液，開始反應(yīng)，注意準(zhǔn)確時(shí)間，在28℃下保溫至混合物產(chǎn)生淡黃色。
d. 加入0.5ml碳酸鈉母液終止反應(yīng)，注意準(zhǔn)確記錄反應(yīng)終止的時(shí)間，在420nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度。
9．采用Bradford(1976)染料結(jié)合測(cè)定法測(cè)定抽提物中的蛋白質(zhì)濃度。
a. 用蒸餾水將Bradford試劑稀釋5倍。用Whatman540號(hào)濾紙過(guò)濾稀釋試劑。
b. 加10～20μl抽提物到1ml稀釋試劑中，并混合。在595nm波長(zhǎng)下測(cè)定形成的藍(lán)色溶液。用一次性塑料比色杯以防止形成藍(lán)膜影響測(cè)定結(jié)果。
c. 將BSA溶解于裂解緩沖液中，選用幾個(gè)不同稀釋度(0.1～1mg/ml)制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。
10． 根據(jù)下面公式計(jì)算抽提物的特異活性：
( OD420×1.7) /(0.0045×蛋白質(zhì)×抽提物體積×時(shí)間)
2) 通透細(xì)胞測(cè)定法
1．按上述方法培養(yǎng)細(xì)胞，測(cè)定培養(yǎng)物的OD600，當(dāng)培養(yǎng)物細(xì)胞密度達(dá)1×106～1×107細(xì)胞/ml，同方法1離心收集細(xì)胞。
2．棄上清液，將細(xì)胞懸浮于1ml Z緩沖液中。
3．加入3滴氯仿和2滴0.1％ SDS，高速振蕩10秒鐘。
4．28℃下預(yù)保溫樣品5分鐘，同方法1加入0.2ml ONPG開始反應(yīng)。
5．當(dāng)試管中的樣品變?yōu)榈S色時(shí)，加入0.5ml碳酸鈉母液終止反應(yīng)。注意在測(cè)定時(shí)所花時(shí)間，離心10分鐘，棄細(xì)胞碎片和沉淀物。
6．測(cè)定反應(yīng)物OD420的光密度。
7．β-半乳糖苷酶的活性單位為：
OD420 /(培養(yǎng)物OD600的光密度×測(cè)定體積×時(shí)間)