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冷凍干燥和液氮保藏菌種技術(shù)
最近更新時間：2011-5-23
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冷凍干燥菌種的轉(zhuǎn)接技術(shù)：
建議用下列方法恢復(fù)培養(yǎng)冷凍干燥保藏的菌種。
－、安瓶管開封
1．用浸過70％酒精的脫脂棉擦凈安瓿管。
2．用火焰將安瓿管頂端加熱。
3．滴無菌水至加熱的安瓿管頂端使玻璃開裂。
4．用挫刀或鑷子敲下已開裂的安瓿管的頂端。
二、菌株恢復(fù)培養(yǎng)
1．用無菌吸管，吸取0.3～0.5ml適宜的液體培養(yǎng)基，滴人安瓿管內(nèi)，輕輕振蕩，使凍于菌體溶解呈懸浮狀。
2．取0.1～0.2ml菌體懸浮液，移植于適宜的瓊脂斜面／平板培養(yǎng)基上，剩余的菌液，注入適宜的液體培養(yǎng)基內(nèi)，然后在建議的溫度下培養(yǎng)。
3．若未能活化，或活化后有疑問時，請于收到菌種1個月內(nèi)，通知保藏中心，經(jīng)查證無誤后，即免費補寄。
三、注意事項
1．菌種活化前，請將安瓿管保存在6一10℃的環(huán)境下。
2．厭氧菌的培養(yǎng)，如無特別說明，自開封至接種完成，均需以無氧氣體充填，以保持厭氧狀態(tài)。
3．某些菌種經(jīng)過冷凍干燥保存后，延遲期較長，需連續(xù)兩次繼代培養(yǎng)才能正常生長，此時請將步驟二（2）重復(fù)一次。
液氮超低溫保藏程序：
1、容器的選擇：使用帶螺旋蓋的2ml塑料安培瓶。
2、檢查安培瓶是否滲漏：用0.05%的亞甲基藍水溶液在4℃浸泡30-45分鐘，沖洗干凈，棄去含有藍色染料的安培瓶，其余的安培瓶備用。
3、打印標簽（激光打印）。
4、容器的滅菌：先用蒸餾水漂洗干凈安培瓶，再用蒸餾水在滅菌鍋中121℃浸泡滅菌15分鐘，干燥并將打印好的標簽放入安培瓶中，略擰緊螺旋蓋，再行121℃滅菌30分鐘。
5、保藏菌菌齡：處于zui大生長量階段或?qū)?shù)生長期后期。
6、保護劑：選用5-10%的甘油或二甲基亞砜作保護劑。
1）甘油的準備：在121℃滅菌15分鐘，2-8℃貯存。甘油一般以兩倍zui終所需濃度的水溶液保存，然后與同等量的細胞懸液混合。若不用細胞懸液，則以zui終所需濃度的水溶液保存。
2）二甲基亞砜：用0.22um的聚四氟乙烯過濾膜過濾除菌。過濾膜預(yù)先用甲醇和二甲基亞砜漂洗。無菌的二甲基亞砜以10-15ml裝量2-8℃避光保存。
7、分裝：在無菌條件下，將細胞懸液（從平板上打下直徑為5cm的菌塊）分裝于安培瓶中，并注入保護劑，擰緊螺旋蓋。
8、將安培瓶固定在鋁夾上，貼好標簽。為了便于取用，一般一個鋁夾上僅放一個菌株。
9、將控溫系統(tǒng)先預(yù)冷到4℃，再將鋁夾放入其中。以每分鐘1℃降溫至-40℃，然后以每分鐘10℃降溫至-90℃。降溫以后，將鋁夾轉(zhuǎn)移至處于液氮中的儲存器中保存。
10、菌種的復(fù)活：將液氮保藏的菌種取出，迅速放入37℃水浴中解凍。一般需2至2.5分鐘,等*解凍后，再及時轉(zhuǎn)接到合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。