寡核苷酸生產過程中的異常情況會導致形成常見雜質，例如缺失一個或多個核苷以及超過預期核苷酸 (N+1 ， N+2 等) 的長鏈寡核苷酸，雜質性質與主成分非常接近，所以分離分析十分具有挑戰性。
上一期我們探討了反相離子對分離分析寡核苷酸。于此同時，由于寡核苷酸由于其帶負電的磷酸骨架，可通過陰離子交換色譜進行寡核苷酸分析檢測，基于帶負電荷的磷酸糖骨架與帶正電荷的鍵合固定相相互作用，目標分子吸附在固定相，通過增加流動相的離子強度使得寡核苷酸被洗脫，實現良好的保留和分離效果。所以離子交換色譜法是分離寡核苷酸的一種常用技術。
Shim-pack
Bio IEX Q-NP
Shim-pack Bio IEX Q-NP采用聚合物材料，使得流動相耐受性更強，耐受寬pH值，無孔基質使得擴散更小，峰形更尖銳；鍵合季銨基團，鍵合技術使得分離效果優異；良好的粒徑均一性使得色譜柱柱效更高。
可實現寡核苷酸 n、n-1 良好分離分析
針對具有二級結構的寡核苷酸，具有選擇性企業性質
適用于硫代磷酸酯（PS）寡核苷酸的分離分析
對于PO雜質的分離分析展現優異的分離效果
?
案例1：單鏈寡核苷酸n，n-1雜質分離
案例2：DNA片段雜質分離分析
色譜柱使用
注意事項
根據樣品的吸附差異，在方法開發過程中可以不同種類的緩沖液和洗脫鹽類型，因為它們都可以顯著影響峰形和分辨率。
可以選擇不同的pH鹽，例如Tris-HCl 、NaOH緩沖液與NaCl或者NaClO4搭配使用。
一般情況下，目標樣品以20 ~ 50 mM的緩沖溶液為弱洗脫流動相，此時通常樣品待測物吸附到色譜柱上，然后通過鹽濃度梯度（NaCl或者高氯酸鈉進行洗脫，濃度一般通過梯度增加到0 ~ 0.5 M左右，有的時候可能更高），或pH梯度洗脫。 建議每次運行時用含有1m NaCl的緩沖溶液清洗色譜柱，以去除殘留在柱上的雜質，這些雜質在最終流動相中沒有被洗脫。
高pH條件以及高柱溫可以有效提升分辨率。但是如果樣品的穩定性較差，則推薦使偏中性洗脫液，溫度40℃條件下分離
PS修飾的寡核苷酸的保留大大增加，對于PS修飾寡核苷酸的純化，高pH和離子強度有利結合分子的洗脫，洗脫流動相選擇NaClO4更合適。
一般來說，通過離子交換進行生物分子的分離分析，采用的是水相緩沖體系，但對于寡核苷酸的純化，對分離效率要求較高。在流動相中加入有機改性劑可以改變分離效果，一般不超過30%
不要使用含有氧化劑的溶劑作為流動相。
色譜柱保存在20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.1)中。
色譜柱柱溫最高不要超過60℃使用，
色譜柱耐受的pH范圍是2-12。
脂溶性物質和弱極性物質可能吸附到色譜柱上，導致停留時間、峰形 和壓力的變化。在這些情況下，按照程序洗滌色譜柱：依次使用(1) 0.2 N NaOH水溶液/乙腈（80/20）；(2) 1 M醋酸水溶液；(3)加入非離子表面活性劑的流動相；(4)流動相為6m鹽酸胍，依次沖洗4-5mL。每次沖洗溶劑注入清洗后，檢查 保留時間和峰形是否恢復。
5
立即詢價
您提交后，專屬客服將第一時間為您服務