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質粒大量提取試劑盒 solarbio
貨號：D1110
規格：10T

保存：常溫保存，復檢期一年。

產品說明：
    本試劑盒采用堿裂解法裂解細胞，通過吸附柱在高鹽狀態下特異性地結合溶液中的DNA的特性提取質粒DNA。吸附柱中采用的硅基質材料能高效、專一地吸附DNA，可大限度去除雜質蛋白質及細胞中其他有機化合物。從50-100ml大腸桿菌LB培養液中，可快速提取200-300μg純凈地高拷貝質粒DNA，提取率達85-90％。使用本試劑盒提取的質粒DNA可適用于各種常規的分子生物學試驗，包括酶切、PCR、測序、連接和轉化等試驗。本試劑盒無需使用酚等有毒試劑，操作安全。

    使用前請先在漂洗液中加入無水乙醇，加入體積請參照瓶體上的標簽。溶液Ⅰ在使用
前先加入 RNaseA（將試劑盒中提供的 RNaseA 全部加入），混勻，置于 2-8℃保存。如非指明，所有離心步驟均為使用臺式離心機在室溫下離心。

操作步驟:
1. 收集 50-100ml 過一夜培養的菌液 11000rpm 離心 10 分鐘，盡量吸除上清(菌液較多時可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中)。
2. 向留有菌體沉淀的離心管中加入 5ml 溶液Ⅰ (請先檢查是否已加入 RNaseA) ，使用移液器或渦旋振蕩器*懸浮細菌細胞沉淀。注意：如果菌塊未*混勻，會影響裂解導致質粒提取量和純度偏低。
3. 向離心管中加入 5ml 溶液Ⅱ ，溫和地上下翻轉 6-8 次使菌體充分裂解。 注意：①翻轉一定要溫和，以免污染細菌基因組 DNA。②作用時間不要超過 5 分鐘，以免質粒受到破壞。
4. 向離心管中加入 7ml 溶液Ⅲ ，立即溫和地上下翻轉 6-8 次，充分混勻，此時會出現白色絮狀沉淀(如菌液過多，可在此步放置 5 分鐘，以盡可能的降解 RNA)。11000rpm 離心 10 分鐘，用移液器小心地將上清轉移到另一個干凈的離心管中，注意盡量不要吸出沉淀。
注意：溶液Ⅲ加入后應立即混勻，避免產生局部沉淀。 如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。

5. 將上一步所得上清液加入吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，室溫放置 2-3 分鐘，11000rpm 離心 30-60 秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中(如為提高得率，可將收集管中的液體加入吸附柱再次吸附一次)。
6. 向吸附柱中加入 8ml 漂洗液(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，11000rpm 離心 2min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。
7. 向吸附柱中加入 6ml 漂洗液，11000rpm 離心 2min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。
8. 11000rpm 離心 5min，將吸附柱敞口置于室溫或 50℃溫箱放置數分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，否則漂洗液中的乙醇會影晌后續的實驗如酶切、PCR 等。
9. 將吸附柱放入一個干凈的離心管中，向吸附膜中央懸空滴加 1-2ml 經 65℃水浴預熱的洗脫液，室溫放置 5min，11000rpm 離心 2min，收集質粒溶液用于后續實驗。
10. 為了增加質粒的回收效率，可將得到的洗脫液重新加入吸附柱中，室溫放置 5min， 11000rpm 離心 2min。

產品包裝：

注意事項：

1、溶液Ⅰ在使用前先加入RNaseA(將試劑盒中提供的RNaseA全部加入)，混勻，置于2-8℃保存。
2、*次使用前應按照試劑瓶標簽的說明在漂洗液中加入無水乙醇配制成工作液(向15ml的漂洗液中加入60ml的無水乙醇)。
3、使用前請先檢查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出現混濁，如有混濁現象可在37℃水浴中加熱幾分鐘，待溶液恢復澄清后再使用。
4、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ和漂洗液使用后應立即蓋緊蓋子，如非指明，所有離心步驟均為使用臺式離心機室溫下進行離心。
5、如果是提取革蘭氏陽性菌質粒，必須在裂解細胞前破細胞壁，方法如下：收集適量菌體，加入5ml溶液Ⅰ，充分懸浮菌體，加入溶菌酶終濃度為10-20mg/ml，37℃處理30min左右。加入溶菌酶的濃度和處理時間可根據不同的菌株和具體試驗條件進行調整。
6、洗脫緩沖液的體積好不少于1ml，體積過小會影響回收效率；洗脫液的pH值對洗脫效率也有影響，若需要用水做洗脫液
應保證其pH值在8.0左右(可用NaOH將水的pH值調此范圍)，pH值低于7.0會降低洗脫效率。

 

相關文獻：

 《A rapid and efficient one-step site-directed deletion, insertion, and substitution mutagenesis protocol》 作者:Deguang Wu，Xuewu Guo，Jun Lu，Xi Sun，Feng Li，Yefu Chen，Dongguang Xiao 期刊:Analytical Biochemistry 影響因子:2.275 PMID:23256925
《Enhanced freeze tolerance of baker’s yeast by overexpressed trehalose-6-phosphate synthase gene (TPS1) and deleted trehalase genes in frozen dough》 作者:Haigang Tan,Jian Dong,Guanglu Wang,Haiyan Xu,Cuiying Zhang,Dongguang Xiao 期刊:Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 影響因子:2.533 PMID:24951963
《A two-step integration method for seamless gene deletion in baker’s yeast》 作者:Jian Dong，Guanglu Wang，Cuiying Zhang，Haigang Tan，Xi Sun，Mingyue Wu，Dongguang Xiao 期刊:Analytical Biochemistry 影響因子:2.275 PMID:23597844

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