YIJI 線粒體呼吸鏈復合物 I 活性比色法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）
主要用途
YIJI 線粒體呼吸鏈復合物 I（NADH－輔酶 Q 還原酶）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在使用合成
輔酶 Q 同功類似物和特異性抑制劑，通過反應系統測定樣品中還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧
化后峰值的降低，即采用比色法測定樣品中酶活性的而經典的技術方法。該技術由大師級科學家精心
研制、成功實驗證明的。其適合于各種純化線粒體樣品（動物、人體、酵母）以及細胞或組織裂解懸液樣
品的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）－輔酶 Q 還原酶的特異性活性檢測。其用于衰老、能量代謝、
蛋白組學、病理生理學、神經病變等研究。產品不含污染性蛋白酶，嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性
能穩定，反應優化，檢測敏感。
技術背景
線粒體呼吸鏈復合物I，通常稱為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸輔酶Q還原酶（reduced nicotinamide adenine
dinucleotide coenzyme Q reductase；NADH-CoQ reductase），又稱為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶
（reduced nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase；NADH dehydrogenase），是線粒體電子傳遞鏈中
zui大的結構成分：含有30至40多個多肽結構。其特征性的酶活性是魚藤酮敏感的NADH－輔酶Q還原酶
（NADH:Q Reductase）。復合物I催化線粒體內電子由供體NADH傳遞到內膜上輔酶Q受體（泛醌；
ubiquinone）的能量轉移反應，為整個呼吸鏈反應系統的*步。基于輔酶Q底物，在魚藤酮存在與否的情
況下，通過NADH－輔酶Q還原酶的催化，轉化成還原型泛醌（CoQH2），同時還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷
酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide
adenine dinucleotide；NAD），在分光光度儀下產生吸收峰值的變化（340nm 波長），由此定量測定NADH
－輔酶Q還原酶的特異活性。其反應系統是：
產品內容
YIJI 緩沖液（Reagent A）
YIJI 反應液（Reagent B）
YIJI 陰性液（Reagent C）
YIJI 底物液（Reagent D）
YIJI 專性液（Reagent E）
產品說明書
毫升
毫升
毫升
微升
微升
1份
保存方式
保存在－20℃冰箱里，避免反復凍融；YIJI 反應液（Reagent B）含有毒性物質，避免直接用手接觸；
YIJI 反應液（Reagent B）和 YIJI 底物液（Reagent D），避免光照，有效保證 6 月
用戶自備
比色皿：用于比色分析的容器
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雙波長分光光度儀：用于比色分析
培養箱：用于孵育反應物
實驗步驟
實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；YIJI 反應液（Reagent B）和
YIJI 底物液（Reagent D）注意避光。然后進行下列操作。
一、 測定準備
1． 準備好待測樣品（例如純化線粒體樣品等），置于冰槽里（注意：檢測前溶解線粒體；參見注意事項 5）
2． 設定好雙波長分光光度儀（溫度為 30℃）：波長分別為 340nm 和 380nm，間隔 30 秒，讀數 7 次（共 3
分鐘），并置零（注意：參見注意事項 11）
二、 背景對照測定
1． 移取 xx 微升 YIJI 緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
2． 加入 xx 微升 YIJI 反應液（Reagent B）
3． 加入 xx 微升 YIJI 底物液（Reagent D）
4． 放進 30℃培養箱里靜置 3 分鐘
5． 加入 xx 微升 YIJI 陰性液（Reagent C）
6． 上下傾倒數次，混勻（限定在 3 秒之內）
7． 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照：
（340 波長讀數－380 波長讀數）0 分鐘－（340 波長讀數－380 波長讀數）1 分鐘或 3 分鐘
三、 樣品總活性測定
1． 移取 xx 微升 YIJI緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
2． 加入 xx 微升 YIJI反應液（Reagent B）
3． 加入 xx 微升 YIJI 底物液（Reagent D）
4． 放進 30℃培養箱里靜置 3 分鐘
5． 加入 xx 微升待測樣品（注意：10 微克總線粒體蛋白；樣品須溶解；參見注意事項 5）
6． 上下傾倒數次，混勻（限定在 3 秒之內）
7． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數：
（340 波長讀數－380 波長讀數）0 分鐘－（340 波長讀數－380 波長讀數）1 分鐘或 3 分鐘
四、 樣品非特異活性測定
1． 移取 xx 微升 YIJI緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
2． 加入 xx 微升 YIJI反應液（Reagent B）
3． 加入 xx 微升 YIJI專性液（Reagent E）
4． 加入 xx 微升 YIJI底物液（Reagent D）
5． 放進 30℃培養箱里靜置 3 分鐘
6． 加入 100 微升待測樣品（注意：10 微克總線粒體蛋白；樣品須溶解；參見注意事項 5）
2

7． 上下傾倒數次，混勻（限定在 3 秒之內）
8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品非特異活性讀數：
（340 波長讀數－380 波長讀數）0 分鐘－（340 波長讀數－380 波長讀數）1 分鐘或 3 分鐘
五、 計算樣品活性
1）樣品活性（總活性或非特異活性）
【（樣品讀數－背景讀數）
單位＝微摩爾 NADH/分鐘
＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克
2）樣品特異活性
樣品總活性測定－樣品非特異活性測定＝樣品特異活性
注意事項
1． 本產品為 21 次（10 個樣本）操作，包括背景對照測定
2． 操作時，須戴手套
3． YIJI反應液（Reagent B）含有毒性物質，避免直接用手接觸
4． 系統操作過程中，背景測定只需 1 次
5． 線粒體樣品檢測前，須溶解；建議凍存融解（－70℃至 37℃）循環 3 次或使用 YIJI線粒體溶解
試劑盒－GMS10018
6． 加入樣品啟動反應后 3 秒內即刻比色測定
7． 通常反應 1 分鐘后比色測定值趨于穩定；測定值由高到低變化；測定可以持續 3 分鐘
8． 測定值由高到低變化，即 3 分鐘測定讀數低于 0 分鐘測定讀數，表明有酶活性
9． 比色測定后，比色皿須清洗*
10．通常比色測定的 OD340 起始讀數 0.5 為理想狀態
11．如果用戶沒有雙波長同步測定分光光度儀，可以使用單波長 340nm 替代，注意活性計算時，毫摩爾吸
光系數變成 6.2
12．建議待測樣本線粒體蛋白濃度為 10 微克/100 微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣
本量；注意計算公式的調整（本公司提供 YIJI線粒體溶解試劑盒 GMS10018 為后續的線粒體蛋
白濃度測定的預處理試劑盒和 YIJI Bradford 蛋白質濃度定量試劑盒 GMS30030.1）
13．如果使用細胞或組織裂解懸液，則蛋白濃度為 50 微克/100 微升
14．樣品特異活性是指魚藤酮敏感的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸－輔酶 Q 還原酶，去除其它干擾因素（例
如復合物 II/III/IV 等）
15．線粒體呼吸鏈復合物 I（NADH－輔酶 Q 還原酶）單位活性定義為：在 30℃，pH 7.5 條件下，每分鐘
內能夠氧化 1 微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個活性單位
16．本公司提供系列線粒體及其酶類技術產品
質量標準
1． 本產品經鑒定性能穩定
2． 本產品經鑒定檢測準確