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行業(yè)產(chǎn)品
當(dāng)前位置:上海一基實(shí)業(yè)有限公司>>公司動(dòng)態(tài)>>RAPD
RAPD-原理
RAPD擴(kuò)增圖
RAPD,即隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù),是由美國(guó)科學(xué)家Wiliams和Welsh于1990年分別研究提出的,又稱任意引物PCR。它的應(yīng)用是基于這樣的一個(gè)推理:對(duì)于同一模板DNA,用同一引物擴(kuò)增既可能得到相同的帶譜(模板基因組間可能具有同源性),也可能得到不同的帶譜。僅在某一特定模板中出現(xiàn)的條帶就可作為該模板的分子標(biāo)記。事實(shí)上,不同基因組DNA總是一定差異的,所以用就可以進(jìn)行分子標(biāo)記研究。理論上講,在一定的擴(kuò)增條件下,擴(kuò)增的條帶數(shù)取決于基因組的復(fù)雜性。對(duì)特定的引物,復(fù)雜性越高的基因組所產(chǎn)生的擴(kuò)增條帶數(shù)也越多。
90年代前期技術(shù)得到廣泛的應(yīng)用,幾乎所有的作物都有這方面的研究報(bào)告。但隨著研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)該技術(shù)存在一定的缺陷,并對(duì)此作了一些探索。
-特點(diǎn)
技術(shù)目前運(yùn)用相當(dāng)廣泛, 幾乎滲透于整個(gè)基因組研究的各個(gè)方面, 這與它所具有的眾多優(yōu)勢(shì)是分不開的。
① 無(wú)需專門設(shè)計(jì) 擴(kuò)增反應(yīng)引物,也無(wú)須預(yù)先知道被研究生物基因組的核苷酸序列,引物可隨機(jī)合成和隨機(jī)選定,長(zhǎng)度一般為9- 10 個(gè)核苷酸;
② 每個(gè) 反應(yīng)中,僅加單個(gè)引物,就可通過(guò)引物和模板DNA 隨機(jī)配對(duì)實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增,擴(kuò)增無(wú)特異性;
③ 退火溫度低,一般為36℃,這樣的溫度能保證核苷酸引物與模板的穩(wěn)定結(jié)合,同時(shí)允許適當(dāng)?shù)腻e(cuò)誤配對(duì),以擴(kuò)大引物在基因組DNA中配對(duì)的隨機(jī)性,使 有較高的檢出率;
④ 技術(shù)簡(jiǎn)便易行、省時(shí)省力,不需要RFLP 分析的預(yù)備性工作:如克隆的制備、同位素標(biāo)記、Southern 印記反應(yīng)及分子雜交。 易于程序化,利用一套隨機(jī)引物可得到大量的分子標(biāo)記,并可借助于計(jì)算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行分析;
⑤ 分析所需的DNA 樣品量極少,僅為RFLP 的1ö 1000 - 1ö 200,這對(duì)于生物早期取樣鑒定或在DNA 受限制的情況下是十分有利的。
-試驗(yàn)條件
-原理
1. 藥品試劑
模板DNA(10~100ng)
寡核苷酸引物(20mmol/L貯存液,可向Operon Technologies或Perkin Elmer公司購(gòu)買,也可以自己合成)
0.2 mmol/L dNTPs(必須使用高質(zhì)量的dNTPs,這一點(diǎn)非常重要。dNTPs經(jīng)反復(fù)化凍后會(huì)發(fā)生降解,因此應(yīng)分成小份保存。應(yīng)注意混合物中四種dNTP的量要相等)
Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut)
10×PCR緩沖液(500 mmol/L KCl, 15 mmol/L MgCl2, 100 mmol/L Tris•HCl, pH 8.3)
礦物油
電泳所需試劑
2. 儀器設(shè)備
PCR擴(kuò)增儀
電泳裝置
微量離心機(jī)
微量移液器(1~20ml和20~200ml)
0.5 ml Eppendorf管
-操作程序
(1)在冰里向無(wú)菌的Eppendorf管中加入以下反應(yīng)物:
水 14.75 ml
10×緩沖液 2 ml
10×dNTPs 2 ml
引物(20 mmol/L) 0.2 ml
Taq DNA聚合酶
終體積
DNA(10~100ng) 1 ml
石蠟油 20 ml
(2)93℃反應(yīng)2 min后開始如下循環(huán):
93℃變性反應(yīng)1min
56℃退火反應(yīng)1min
72℃延伸反應(yīng)1.5min
經(jīng)過(guò)45個(gè)循環(huán)后,zui后一個(gè)循環(huán)72℃增加5min,循環(huán)結(jié)束后反應(yīng)產(chǎn)物置于4℃保存。
(3)20ml反應(yīng)產(chǎn)物走凝膠電泳,經(jīng)溴化乙錠染色檢測(cè)擴(kuò)增的情況。
-試驗(yàn)注意及解決方法
(1)擴(kuò)增偏差或無(wú)擴(kuò)增。
――在部分或全部管中缺少一個(gè)組分。重復(fù)少量幾個(gè)反應(yīng)以確定所有的PCR組分是否都已加入。
――PCR抑制物可能與DNA一起純化,改變DNA的濃度。
――在DNA分離中加入一個(gè)清洗步驟(如苯酚抽提)。
――稀釋新的DNA溶液。
――引物母液失效。重新配制母液,使用不同的引物或提高引物濃度。
――延長(zhǎng)退火時(shí)間(在PCR程序中的第二部分),或降低升溫轉(zhuǎn)換步驟之間的速率。
――提高每個(gè)反應(yīng)中的Taq聚合酶的濃度。
――補(bǔ)加新的組分,該滅菌的都高壓滅菌。
(2)擴(kuò)增結(jié)果差,條帶模糊或難以辨認(rèn)。
――更換Taq聚合酶緩沖液。
――檢查引物(使用另外一個(gè)引物,或者將引物末端標(biāo)記,在16% 6mol/L尿素聚丙烯酰胺膠上電泳檢測(cè))。
――檢查Taq聚合酶活性(與不同批量的酶作比較)。
――改變DNA濃度。
(3)高相對(duì)分子質(zhì)量產(chǎn)物彌散狀分布>4kb。
――降低DNA濃度。
――降低Taq聚合酶濃度。
――減少凝膠上樣量。
――可能是由于循環(huán)數(shù)過(guò)多的結(jié)果(Bell和Demarini 1991),減少循環(huán)數(shù)。
――確認(rèn)是否使用正確的緩沖液(不是水!)制備凝膠。
――在較低的電壓下電泳。
(4)在對(duì)照和所有檢測(cè)樣品中均為一條很強(qiáng)的單一帶。
――確認(rèn)引物序列不是回文結(jié)構(gòu)。這可能是引物多聚體造成的結(jié)果。使用不同的引物。
(5)帶譜不可重復(fù)。
――DNA過(guò)多或過(guò)少。把基因組DNA濃度控制在10~100ng范圍之內(nèi),DNA量太少時(shí),“真正”靶序列與引物的結(jié)合效率低,因此引物擴(kuò)增會(huì)產(chǎn)生假的條帶,這就稱為引物偽跡;DNA量太多會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤配對(duì)(指引物與基因組DNA的配對(duì))。每個(gè)樣品進(jìn)行兩個(gè)不同DNA濃度的反應(yīng)。
――只考慮主要條帶。
(6)染色后凝膠背景太強(qiáng)影響分辨率。
――減少染色時(shí)間。
――凝膠脫色時(shí)間延長(zhǎng)。
――PCR反應(yīng)中DNA含量或Taq聚合酶過(guò)多。
(7)低相對(duì)分子質(zhì)量產(chǎn)物分離不充分。
――在更高濃度的瓊脂糖凝膠、專業(yè)純凝膠或聚丙烯酰胺凝膠上分離產(chǎn)物。
-技術(shù)問(wèn)題及對(duì)策
技術(shù)是由多種成分參加的生化反應(yīng),反應(yīng)中各種成分均為微量,盡管其反應(yīng)靈敏度高,但是影響因素較多,會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性差等一些問(wèn)題。為了得到較穩(wěn)定的結(jié)果,各種反應(yīng)參數(shù)必須事先優(yōu)化選擇,操作中每一步都必須小心謹(jǐn)慎,以防止出現(xiàn)差錯(cuò)。
1 溫度
一般反應(yīng)條件是:變性92-95℃,常用94℃,30-60s;延伸72℃,60-120s;退火35-37℃,30-60s。變性和延伸溫度一般沒(méi)有太大變化,而退火溫度影響較大。退火溫度低,引物和模板結(jié)合特異性較差,出現(xiàn)的條帶可能增多;退火溫度高,引物和模板結(jié)合特異性增加。有人提出,在尋找基因差異為目的的實(shí)驗(yàn)中,退火采用33-34℃效果更好。在優(yōu)化方案中,退火溫度可能要提高,以便降低背景,得到少而清晰的"帶"。溫度的梯度率也是十分重要的,特別是退火與延伸之間的梯度尤為重要。各種儀器的控溫、升降溫性能均有差別,一些儀器(如一些舊型號(hào)的儀器)在到達(dá)特定的溫度前就開始計(jì)時(shí),一些PCR儀顯示的溫度與實(shí)際溫度會(huì)有差異。這些在設(shè)計(jì)程序和結(jié)果分析時(shí)有必要考慮,所以注明所用儀器的生產(chǎn)廠家、品牌、規(guī)格,就顯得很有必要,對(duì)于同一批實(shí)驗(yàn),注意控制在同樣的溫度條件下進(jìn)行反應(yīng),結(jié)果才有可比性。
2 反應(yīng)物的影響
PCR擴(kuò)增受多種成分的制約,產(chǎn)物僅在部分循環(huán)中呈指數(shù)式(2)增長(zhǎng),逐漸將達(dá)到一個(gè)平臺(tái)期,模板是關(guān)鍵制約因素之一,產(chǎn)物取決于此,實(shí)驗(yàn)中非常的模板濃度是十分關(guān)鍵的一個(gè)步驟。濃度過(guò)低,分子碰撞機(jī)率低,偶然性大,擴(kuò)增產(chǎn)物不穩(wěn)定;濃度過(guò)高,會(huì)增加非專一性擴(kuò)增產(chǎn)物。更重要的是,若循環(huán)數(shù)控制不好,引物過(guò)早消耗完,后面循環(huán)中,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的3端會(huì)和原模板及每一次循環(huán)的擴(kuò)增產(chǎn)物退火,造成不等長(zhǎng)度的延伸。因此,如果原模板濃度過(guò)高,非專一性擴(kuò)增產(chǎn)物就足以形成背景,這是高濃度模板造成彌散型產(chǎn)物的原因。相對(duì)而言,模板純度影響不大,即反應(yīng)液中蛋白質(zhì)、多糖、RNA等大分子物質(zhì)影響不大。理想的模板和引物濃度能產(chǎn)生多態(tài)性豐富、強(qiáng)弱帶分明的圖譜。引物3端的重要性似乎更大。此外,Mg+2濃度也影響反應(yīng)的參數(shù)包括產(chǎn)物的特異性和引物二聚體的形成,人們?cè)诟髯缘膶?shí)驗(yàn)中得出不同的結(jié)論,大約在1.5-4mmol/L范圍內(nèi)。總之,各種反應(yīng)物的濃度應(yīng)事先進(jìn)行篩選優(yōu)化。
3 污染問(wèn)題
實(shí)驗(yàn)中應(yīng)設(shè)空白對(duì)照,因?yàn)橐铩⒏鞣N緩沖液和雙蒸水都會(huì)造成污染。而且Taq酶也可能出現(xiàn)污染,給分析帶來(lái)困難,所以必須設(shè)置對(duì)照以排除系統(tǒng)誤差。并且,酶也盡可能優(yōu)化。
4 擴(kuò)增條帶的取舍
重復(fù)性問(wèn)題 為了克服重復(fù)性差的問(wèn)題,應(yīng)設(shè)置重復(fù)實(shí)驗(yàn)。作為DNA多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)的條帶是應(yīng)該可重復(fù)的,重復(fù)性好是zui重要的取舍指標(biāo),而帶的強(qiáng)弱不應(yīng)該作為取舍的指標(biāo)。有學(xué)者認(rèn)為帶的強(qiáng)弱與其在基因組中的拷貝數(shù)有關(guān)。但據(jù)Thormann對(duì)十字花科植物分析,產(chǎn)物的強(qiáng)弱與該產(chǎn)物在基因組中的拷貝數(shù)無(wú)直接關(guān)系,而與引物及模板的同源性程度有關(guān)。分析一個(gè)位點(diǎn)時(shí),要作全面分析,若某一個(gè)體的全部帶均弱,其模板可能有問(wèn)題(濃度、分子量);若某一個(gè)體的大部分帶與其它個(gè)體強(qiáng)度一致,僅有一條或少數(shù)幾條帶弱,可能存在拷貝數(shù)差異。重復(fù)性不好的弱帶(無(wú)規(guī)律出現(xiàn)的帶)可能由非專一性擴(kuò)增、產(chǎn)物間退火或其它人為因素造成,不能記錄。
異源雙鏈問(wèn)題 Ayliffe研究亞麻銹病菌時(shí)發(fā)現(xiàn)F1代中出現(xiàn)的一條帶在親本中沒(méi)有出現(xiàn),進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這一條帶是由2個(gè)等位基因組成的異源雙鏈形成的,這2個(gè)等位基因除中間插入的38bp的序列外,其余序列相同。這種條帶可以在后代中遺傳,在該研究中這種條帶大約占0.16%。在蜜蜂的研究中也發(fā)現(xiàn)了相似的問(wèn)題,這種條帶可以用單鏈核酸酶將其消除。也可以將電泳溫度提高到60℃以上,使異源雙鏈變性,以消除其影響。
非孟德爾遺傳的條帶 Heun等分析認(rèn)為,在顯示多態(tài)性的非模糊條帶中有92.5%的表現(xiàn)為孟德爾顯性遺傳,其余的條帶不符合孟德爾遺傳,分析認(rèn)為可能由不同的序列組成。一般實(shí)驗(yàn)中大多采用符合孟德爾遺傳的條帶進(jìn)行分析。在連鎖圖譜分析中,基因型錯(cuò)誤可以部分消除,即在F1代或1:1混合物中沒(méi)有出現(xiàn)的條帶,在其父母本中應(yīng)盡可能去掉。
同一條帶的同源性問(wèn)題 Thormann將產(chǎn)物標(biāo)記作探針,雜交結(jié)果表明,與探針片斷遷移率一致的帶有時(shí)并不同源,這種情況僅發(fā)生在種間。并比較了RFLP和標(biāo)記在種內(nèi)和種間得出的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)RFLP和標(biāo)記在種內(nèi)水平的結(jié)果*吻合,但在種以上等級(jí)的結(jié)果相差甚遠(yuǎn),這說(shuō)明在電泳結(jié)果的同一個(gè)帶中,有可能存在序列不同但分子量相同的幾條帶,無(wú)法檢測(cè)。這種可能在種內(nèi)較少發(fā)生,而這種間可能性較大,Castagna用RFLP和比較研究也得出了相同的結(jié)論。
5 電泳分辨率問(wèn)題
電泳時(shí),基因組不同位置的擴(kuò)增產(chǎn)物共同移動(dòng)的可能性是有的,即不同分子量的擴(kuò)增產(chǎn)物可能在電泳時(shí)沒(méi)有分開而形成一條帶,凝膠分離系統(tǒng)和基因組的親緣關(guān)系有可能提高這種概率。一般而言,聚丙烯酰胺和銀染的分辨效果比瓊脂糖和溴化乙銨要高,用較長(zhǎng)(可達(dá)到20cm)或濃度更高(2%)的瓊脂糖凝膠有助于提高分辨率。當(dāng)然,隨著分辨率和靈敏度的提高,更可能出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)誤差。所以有人評(píng)述:zui保險(xiǎn)而簡(jiǎn)單的方法是用瓊脂糖電脈分離而且只注意那些無(wú)疑而重發(fā)性高的帶。但是,聚丙烯酰胺和銀染所揭示的高信息量的多態(tài)性無(wú)疑可加快分子標(biāo)記的鑒定過(guò)程。
6 顯性標(biāo)記問(wèn)題
標(biāo)記來(lái)自于模板DNA的復(fù)制,經(jīng)過(guò)30一40次循環(huán),擴(kuò)增條帶數(shù)量理論上可達(dá)2。原模板中擴(kuò)增位點(diǎn)是純合還是雜合已無(wú)法判斷,因?yàn)榧兒衔稽c(diǎn)的擴(kuò)增條帶只相當(dāng)于雜合位點(diǎn)的2倍,電泳時(shí)無(wú)法檢測(cè)到其差別。雜交中。如果親本一方為純合體,F(xiàn)1代就可以全部表現(xiàn)出該條帶;如為雜合體,該條帶在F1中應(yīng)為l:l分離,即一半后代有該條帶,而另一半則沒(méi)有。當(dāng)然來(lái)自于多拷貝區(qū)的條帶分析更為復(fù)雜。
-應(yīng)用問(wèn)題及策略
1 遺傳圖譜構(gòu)建的問(wèn)題
分析樣品
是一種顯性標(biāo)記,符合孟德爾遺傳定律,不能區(qū)分雜合型和純合型,因此在遺傳分析及遺傳圖譜的構(gòu)建等一些方面受到限制。目前,在實(shí)踐中,主要利用了以下2種方法。
①利用單倍體 利用胚乳進(jìn)行分析,可以克服構(gòu)建遺傳圖譜中這些困難。因?yàn)獒樔~樹的胚乳是單倍體,記錄了雜合的母本染色體組在減數(shù)分裂過(guò)程中的遺傳事件,不存在雜合型,進(jìn)行遺傳分析時(shí),與共顯性標(biāo)記具有同樣的遺傳行為,是天然的優(yōu)良作圖材料。現(xiàn)在已進(jìn)行遺傳圖譜構(gòu)建的有濕地松、歐洲赤松、火炬松、楊樹、日本柳杉和桉樹。但是由于缺乏細(xì)胞遺傳學(xué)的研究,暫時(shí)還不能確定連鎖群和染色體之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。
②將條帶作為單劑量標(biāo)記,單劑量標(biāo)記(Single-dose markers)是從兩物種和其雜交產(chǎn)生F1代的分子標(biāo)記中選擇的。選擇構(gòu)建圖譜用的標(biāo)記有2個(gè)原則:A、它們必須在一個(gè)親本中存在而在另一個(gè)親本中不存在;B、它們?cè)诤蟠斜仨氁詌:1分離。這種方法相當(dāng)于一個(gè)雜合體和一個(gè)隱性純合體的測(cè)交,稱為雙向假測(cè)交(Two-way pseudo-testcross)。在多倍體植物中,不論基因組是如何組成的(異源多倍體或同源多倍體),也不論材料的多倍性水平如何,單劑量的標(biāo)記都相當(dāng)于簡(jiǎn)單的等位基因(同源多倍體)或相當(dāng)于二倍體基因座上的雜合等位基因(異源多倍體)。因此根據(jù)這些單劑量標(biāo)記的連鎖情況可以構(gòu)建分子圖譜。條帶作為單劑量標(biāo)記使那些基因組DNA含zui大,世代周期長(zhǎng)的喬木和多倍體植物的遺傳圖譜研究走出了幾乎停滯的狀態(tài)。Grattapagalia利用這種策略首先構(gòu)建了巨桉和尾葉桉的分子連鎖圖譜。Conner利用這種策略構(gòu)建了3個(gè)蘋果品種的分子圖譜。Mudge利用甘蔗及雜交后代的條帶作為單劑量標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析構(gòu)建了甜根子草的51個(gè)連鎖群,并分析了其染色體組的數(shù)目。雖然這些連鎖圖譜是個(gè)體特異性的,但可以為數(shù)量性狀定位提供框架結(jié)構(gòu),為標(biāo)記輔助選擇育種奠定基礎(chǔ)。
2 系統(tǒng)學(xué)研究中的問(wèn)題
系統(tǒng)學(xué)是研究zui為迅速的領(lǐng)域,許多作物都用作過(guò)親緣關(guān)系分析,大部分結(jié)果和形態(tài)分類結(jié)果相類似,僅有少數(shù)例外。但是近年來(lái),有人對(duì)其結(jié)果的可靠性提出不同的看法,主要有以下幾點(diǎn):
①由于引物的競(jìng)爭(zhēng)性等,基因組的位點(diǎn)有時(shí)不能全部檢出,造成假象上的差異。根據(jù)這種情況,可以認(rèn)為,可以應(yīng)用于種間乃至近緣屬之間關(guān)系的研究,但有一定的局限性。因不同種度的擴(kuò)增產(chǎn)物難以作同源性分析,只能作表征分析,從而只能從相似性或遺傳距離上去分析親緣關(guān)系。其結(jié)果可能與真實(shí)的系統(tǒng)關(guān)系相左。
②因在種間或?qū)匍g的變異水平很高,取樣代表性是一個(gè)較大的問(wèn)題,即利用某一個(gè)體代表一個(gè)種或用一個(gè)種代表一個(gè)屬都可能造成結(jié)果的偏差。因而,能找到群體特異或種特異性的條帶。
③在表征分析中另一個(gè)值得注意的問(wèn)題是一些產(chǎn)物的出現(xiàn)存在相關(guān)關(guān)系,即一個(gè)位點(diǎn)與另一個(gè)位點(diǎn)相連鎖。若將這個(gè)差異單獨(dú)計(jì)算,相當(dāng)于對(duì)某一性狀極度加權(quán)。
④在系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析中,因?yàn)闂l帶具有顯性的遺傳特征,多態(tài)性信息量較低。如果其符合二歧分枝樹的假定,就可以對(duì)變化的性狀予以加權(quán),并進(jìn)行分析。但是許多植物的核基因組是有性的二倍體,而且它們的進(jìn)化歷史是網(wǎng)狀分枝樹,不便于分析。通常認(rèn)為葉綠體、線粒體和有些細(xì)菌及真菌的病原體符合二歧分枝樹的假定。但由于其基因組較小,沒(méi)有重組,它們的信息量只相當(dāng)于核基因組中具有多個(gè)等位基因的一個(gè)同工酶座位,這樣估算的基因多樣性值的標(biāo)準(zhǔn)差理論上會(huì)比有多個(gè)核基因蛋白座位得出的大。其非編碼區(qū)在一些動(dòng)物類群中的進(jìn)化速度很快,因此做種上水平研究時(shí)將會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性,但種下水平影響較小。
⑤和農(nóng)藝性狀的系統(tǒng)分析比較說(shuō)明,二者相差不大,沒(méi)有出現(xiàn)相反的情況。而且比農(nóng)藝性狀提供了更多的遺傳信息。
總之,用作系統(tǒng)分析應(yīng)結(jié)合其它方法,結(jié)果才更有說(shuō)服力。
3 標(biāo)記、定位目的基因
標(biāo)記、定位目的基因是相對(duì)較為緩慢的一個(gè)領(lǐng)域,這是因?yàn)闃?biāo)記探測(cè)的是整個(gè)基因組的變化,包括編碼區(qū)和非編碼區(qū),要和基因位點(diǎn)起來(lái)有一定的困難。一般的變異群體性狀的變化涉及到基因組內(nèi)較大的范圍(微效多基因),不可能全部檢出。而且檢出的多態(tài)性又不一定是性狀變異的標(biāo)志(可能擴(kuò)增于非編碼區(qū))。另一困難是擴(kuò)增的特異性片段有些為重復(fù)序列,轉(zhuǎn)化為RFLP探針有一定困難。據(jù)Grattapaglia用48個(gè)片段所作的雜交實(shí)驗(yàn)表明,有53%來(lái)自于低拷貝區(qū)(1000)。這只有通過(guò)篩選出與單拷貝區(qū)連鎖的標(biāo)記予以解決。如果標(biāo)記和基因位點(diǎn)或性狀不能起來(lái),其實(shí)用價(jià)值就會(huì)大大降低。為此人們作了以下探索。
①利用易位系、回復(fù)突變系、等位基因系、近交重組系等特殊材料 從理論上講,除目的基因及鄰近區(qū)域外,其它部分*一致。如果檢測(cè)出多態(tài)性,差異必定在目的基因及鄰近區(qū)中,也就是說(shuō)標(biāo)記在這個(gè)范圍內(nèi)與目的基因連鎖。但是要獲得這些材料比較困難,例如等位基因系需要回交20代,時(shí)間太長(zhǎng)。分析中一般用近等位基因系NILs(Near isogenic lines),回交6代以上即可。回交6代時(shí),供體DNA的比例為l/128,用找到的與目的基因連鎖的標(biāo)記與目的基因在距離上還相當(dāng)遠(yuǎn)。
②集團(tuán)分離法(BSA)對(duì)不存在上述特殊生物模型的群體,可采用這種方法。即利用F2分離群體為材料,根據(jù)目的基因的表型把F2群體分為2群(例如抗病的和不抗的),每一群中將各個(gè)體DNA等量混合,這樣形成2個(gè)DNA混合池。在每個(gè)基因池中,不管群體性狀如何,在目的基因的表型上都是一致的,2個(gè)群體之間,目的基因的表型都是相反的。因此,在2個(gè)群體之間*不同、在每個(gè)群體之內(nèi)各個(gè)體間又是*相同的擴(kuò)增產(chǎn)物即可認(rèn)為是與目的基因連鎖的標(biāo)記。這種方法相當(dāng)于把分析材料作為近等位基因系。
在找到合適的分子標(biāo)記后,既可直接用于輔助選擇育種(Molecule-marker assisted selection,MAS),也可通過(guò)對(duì)特異片段的分離和兩端測(cè)序?qū)⒅D(zhuǎn)換為序列標(biāo)志位點(diǎn)(Sequence-tagged sites,STS)。從這個(gè)分子標(biāo)記出發(fā)找到目的基因需經(jīng)過(guò)幾個(gè)步驟:A、用稀有切點(diǎn)內(nèi)切酶將基因組DNA切成大片斷DNA;B、用脈沖電泳分離大片斷DNA;C、將大片斷DNA克隆到Y(jié)AC(Yeast artificial chromosome)中,建立YAC文庫(kù);D、以顯示多態(tài)性的擴(kuò)增產(chǎn)物為探針從YAC文庫(kù)中調(diào)出含有該標(biāo)記和與其連鎖的目的基因的大片斷DNA;E、以該標(biāo)記為起點(diǎn)向目的基因進(jìn)行染色體滑步或跳躍,以找到目的基因。Michelmore首先利用這種方法找到了萵苣抗性基因的標(biāo)記,Koller等利用這種方法找到與蘋果瘡痂病抗性基因有關(guān)的分子標(biāo)記。
③利用一套缺體一四體系或雙端體系,以獲得與目的基因連鎖的標(biāo)記引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),然后進(jìn)行原位雜交,確定特異性帶在染色體上的位置。
這些工作在一些基礎(chǔ)研究較多的領(lǐng)域或與人類關(guān)系較為密切的物種中進(jìn)展較為迅速,比如小麥、水稻找到的分子標(biāo)記已有許多。但林木等多年生植物研究進(jìn)展稍遲滯,關(guān)鍵是缺乏合適的群體。
4 純度和外源基因檢驗(yàn)問(wèn)題
雖然由于條帶的靈敏和重復(fù)性等問(wèn)題,純度檢驗(yàn)研究還只停留在實(shí)驗(yàn)階段。但已有的對(duì)大麥、玉米、大豆、棉花、小麥、水稻的實(shí)驗(yàn)表明,技術(shù)是鑒定品種的有效方法。相信其在純度檢驗(yàn)和保護(hù)方面會(huì)取得較為廣泛的應(yīng)用。
- 技術(shù)與PCR 技術(shù)區(qū)別 編輯本段回目錄
技術(shù)源于PCR 技術(shù),但又不同于PCR 技術(shù),差別主要體現(xiàn)在隨機(jī)擴(kuò)增引物上。首先,隨機(jī)擴(kuò)增引物是單個(gè)加入,而不是成對(duì)(正、反向引物) 加入, 其次, 隨機(jī)引物短,一般 技術(shù)采用的引物含10 個(gè)堿基,由于隨機(jī)引物較短,與常規(guī)PCR 相比, 退火溫度較低,一般為35 - 45 ℃。
技術(shù)以一系列隨機(jī)引物對(duì)基因組進(jìn)行檢測(cè),因而能檢測(cè)多個(gè)基因位點(diǎn),覆蓋率比較大,并且引物越多,覆蓋面越廣,遺傳信息也隨之增加,因此 多態(tài)信息含量( PIC) 值波動(dòng)較大,在0. 2 - 0. 9 之間。另外, 指紋呈孟德爾式顯性遺傳。
-中藥材鑒定中的作用
1. 植物藥材相近種類的鑒定
邵鵬柱等在1994 年報(bào)道了對(duì)中藥材人參與西洋參采用Ap2PCR 標(biāo)記進(jìn)行鑒別,他們采用20 個(gè)堿基的Galk ,Seq2 ,24 個(gè)堿基的MB forward ,MB reverse 和27 個(gè)堿基的OTCSbackward 作引物成功地利用AP2PCR 指紋圖譜技術(shù)鑒定出人參和西洋參。1995 年分離人參屬三種植物人參、西洋參、三七(P. notoginseng) 和四種偽品包括桔梗、紫茉莉、櫨蘭、商陸的基因組DNA ,分別采用10 個(gè)堿基的OPC25 和OPC220 作引物,用 標(biāo)記可以明顯地區(qū)別,說(shuō)明DNA 分子也能區(qū)別人參屬三個(gè)品種和人參及其偽品。中國(guó)南方部分省區(qū)有多種菊科不同屬的植物如地膽草、一點(diǎn)紅、苦荬菜、毛大子草、山萵苣、苦苣菜以“土公英”混作蒲公英使用。曹暉等利用Ap2PCR 和分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)蒲公英及六種土公英混淆品進(jìn)行了DNA 指紋鑒別研究,結(jié)果顯示它們的DNA 指紋圖譜存在明顯差異,利用這種差異可以從分子水平上鑒別蒲公英及其混淆品。Kohjyouma M 等采用CTAB 法提取菊科蒼術(shù)屬五種植物茅蒼術(shù)、北蒼術(shù)、單葉蒼術(shù)、關(guān)蒼術(shù)和白術(shù)等新鮮葉片組織的基因組DNA ,利用 技術(shù)獲得了清晰的多態(tài)性DNA 指紋圖譜,能明顯地區(qū)分蒼術(shù)的幾個(gè)品種,發(fā)現(xiàn)在基因水平上單葉蒼術(shù)與茅蒼術(shù)十分接近,而與白術(shù)和關(guān)蒼術(shù)相距較遠(yuǎn),后兩者與北蒼術(shù)又相近似。這一結(jié)果與PFL P ( Restriction fragmentlength polymorphism) 方法得到的結(jié)果相近。說(shuō)明 能有效地鑒別蒼術(shù)屬植物。
2. 植物藥材基原的鑒定
Yamazaki M 等采用酸性緩沖液提取法分離了4 種菊科甘草屬植物光果甘草、甘草、刺毛甘草和刺果甘草的基因組DNA ,通過(guò)對(duì) 指紋圖譜分析,表明光果甘草與甘草遺傳關(guān)系非常接近,刺毛甘草和刺果甘草的遺傳關(guān)系相距較遠(yuǎn),這種結(jié)果與RFL P 所得結(jié)果類似,也與植物分類學(xué)研究吻合。他們進(jìn)一步對(duì)4 種商品甘草藥材(新疆甘草、西北甘草、西伯利亞甘草、阿富汗甘草) 采用 方法作遺傳距離估算,來(lái)對(duì)其進(jìn)行基原鑒別,逐步證實(shí)了阿富汗甘草來(lái)源于光果甘草、西伯利亞甘草來(lái)源于甘草、新疆甘草和西北甘草來(lái)源于刺果甘草。曹暉等以CTAB 微量提取法分離菊科植物地膽草、白花地膽草和假地膽草以及四種商品苦地膽藥材的基因組DNA ,采用長(zhǎng)引MBforward(24 個(gè)堿基) ,GalK(20 個(gè)堿基) 進(jìn)行AP2PCR 擴(kuò)增和用OPC26 (10 個(gè)堿基) 的短引物進(jìn)行 擴(kuò)增,獲得清晰可靠的DNA 指紋圖譜,根據(jù)DNA帶型差異鑒別出地膽草及其混淆品。同時(shí)通過(guò)對(duì)DNA 指紋圖譜的相似度指數(shù)值計(jì)算, 證實(shí)四種商品藥材苦地膽的基原為菊科植物地膽草。
3. 復(fù)方制劑、粉劑中藥材品種的鑒定
中藥材復(fù)方制劑、粉劑等由于其中的各種生藥外觀性狀*遭到破壞,要了解某味藥是否存在,用傳統(tǒng)的鑒定方法有時(shí)難以奏效。但是使用 技術(shù)時(shí),從理論上來(lái)講,如果只要能制備出該種藥材的高度特異性的寡核酸引物,即可達(dá)到鑒定的目的。Ozeki 等采用GTC(異硫氰酸胍) 微量提取法分離人參屬三種植物人參、西洋參和竹節(jié)參以及兩種人參制劑高麗紅參泡茶OTANECHAN(日本的一種人參組織培養(yǎng)物制成的茶) 的基因組DNA ,通過(guò) 分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)人參的根毛組織和干燥藥材產(chǎn)生相同的 指紋圖形,人參、西洋參和竹節(jié)參之間采用不同的引物產(chǎn)生不同的 指紋圖;高麗紅參泡茶中幾乎沒(méi)有DNA 片段擴(kuò)增( 其提取物無(wú)DNA 模板之故) , 但從OTANECHAN 中擴(kuò)增到了與人參愈傷組織相同 指紋的DNA 片段。這表明了 技術(shù)應(yīng)用于中藥傳統(tǒng)制劑中組分鑒別的可能性。黃璐琦等對(duì)來(lái)源于已于13 個(gè)種3 個(gè)變種的天花粉及其類似品共26 份樣品,用8 個(gè)擴(kuò)增多態(tài)性好的引物分別進(jìn)行擴(kuò)增,得到清晰、穩(wěn)定的條帶83 條,然后采取聚類分析的方法。結(jié)果表明全部樣品可被有效地分為三大類:*類是大宗商品和小宗商品,第二類是天花粉藥材商品中極易混淆的湖北栝樓根和紅花栝樓根,第三類全部是混淆品和地區(qū)習(xí)慣用藥。對(duì)不同植物來(lái)源的天花粉,尤其是對(duì)來(lái)自不同組或組上水平的天花粉采 技術(shù)能夠很好地把它們區(qū)別開來(lái),其結(jié)果與物種間的親緣關(guān)系基本一致。這為解決粉末及破碎藥材的鑒定提供了新的方法。
4. 動(dòng)物藥材的鑒定
目前這方面的文獻(xiàn)報(bào)道比較少。王義權(quán)等成功地將 技術(shù)應(yīng)用于六種蛇類的基因組DNA的多態(tài)性檢測(cè),在20 個(gè)引物中找出16 個(gè)引物產(chǎn)生了253 個(gè)擴(kuò)增片段,準(zhǔn)確地區(qū)別了游蛇科5 個(gè)種和蝰蛇科1 個(gè)種,片段分布和片段共享度聚類分析所得的游蛇科5 種蛇之間的親緣關(guān)系與染色體、顱骨和陰莖研究的結(jié)果基本一致。顯示DNA 分子標(biāo)記技術(shù)可以成為一種準(zhǔn)確鑒別蛇類藥材的新方法, 同樣適合于動(dòng)物中藥材的鑒定。
5. 藥材的野生類型與栽培品種的鑒定
由于生態(tài)環(huán)境的改變和人們生產(chǎn)活動(dòng)的影響,中藥材遺傳特性及其生藥品質(zhì)在一定程度上產(chǎn)生了變化,產(chǎn)地和栽培也對(duì)生藥品質(zhì)和藥性產(chǎn)生巨大影響。在人類回歸自然呼聲日益高漲的今天,人們普遍認(rèn)為野生品比栽培品要好。同時(shí),由于經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使,以栽培品冒充野生品的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生,給臨床造成混亂。因野生品和栽培品來(lái)自同一個(gè)物種,植物形態(tài)、藥材性狀、化學(xué)成分、生物活性等往往無(wú)明顯差異,這就需要尋找一種有效的方法進(jìn)行鑒別, 等分子標(biāo)記的產(chǎn)生為這種鑒定提供了良好的應(yīng)用前景。馬小軍等利用、A FL P 標(biāo)記對(duì)人參、圓參與山參品種的研究中發(fā)現(xiàn),、AFLP 標(biāo)記可以用于野生與栽培品種的鑒別,其長(zhǎng)脖類型更接近野生人參。
6. 道地藥材鑒定
道地藥材是人們?cè)陂L(zhǎng)期的臨床實(shí)踐中,經(jīng)臨床總結(jié)作為評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量的綜合標(biāo)準(zhǔn)。它是一種長(zhǎng)期進(jìn)化和生態(tài)適應(yīng)過(guò)程中,某一物種的變種、生態(tài)型、品種或居群適應(yīng)于特定的生態(tài)地理環(huán)境條件所形成的優(yōu)良種質(zhì)資源。道地藥材的研究,包括其形成與鑒定,過(guò)去主要集中于化學(xué)、藥理研究,從DNA 標(biāo)記水平的報(bào)道很少。胡珊梅等用技術(shù)探討澤瀉道地藥材與非道地藥材之間遺傳變異的大小, 并建立了道地藥材的品質(zhì)鑒定方法,為道地藥材研究提供了有益的啟示。可以預(yù)見,借助分子標(biāo)記,對(duì)道地藥材的快速、準(zhǔn)確鑒定,無(wú)疑會(huì)給我們提供新思維、新視野。
-分子生藥學(xué)中的應(yīng)用
目前,標(biāo)記已被廣泛應(yīng)用于分子生藥學(xué)各方面:
①生物多樣性:隨著植物藥研究的不斷深入,可持續(xù)開發(fā)利用藥用植物資源的問(wèn)題越來(lái)越受到重視。應(yīng)用技術(shù)進(jìn)行藥用植物生物多樣性研究,可以在遺傳多樣性水平上了解天然產(chǎn)物多樣性與物種、生態(tài)及地理分布的關(guān)系,挖掘潛在的藥物資源,為開發(fā)新藥尋找途徑。方法可以檢測(cè)物種的遺傳多樣性,探討物種的親緣關(guān)系和進(jìn)化趨勢(shì)。因此它是藥用植物資源保護(hù)和種質(zhì)資源保存的依據(jù),特別是對(duì)瀕危物種的研究更具有實(shí)際意義。
②標(biāo)記可用于生藥分類,在DNA分子水平上鑒別生物不同種、亞種、變種甚至株。
③標(biāo)記可用來(lái)制作生物類生藥系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系上的樹狀圖,特別是種內(nèi)水平。這為生藥親緣進(jìn)化關(guān)系,尋找新的藥用資源開辟了新途徑。
④標(biāo)記可用于構(gòu)建基因圖譜,進(jìn)行基因定位,和對(duì)未知序列的DNApian段擴(kuò)增與測(cè)序。
⑤標(biāo)記亦可用于遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建,指導(dǎo)藥用植物育種,防止品種間雜化和自交,選育優(yōu)良性狀的品
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