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禽流感的實驗室診斷
閱讀：675 發布時間：2011-6-16由A型流感病毒引起的禽流感，其臨床癥狀因感染禽的年齡、種類、飼養管理水平、并發感染情況及新感染毒株的毒力等不同而表現不一致。其病理變化因感染病毒株毒力的高低、病程的長短及種類不同也不盡相同。因此，禽流感的診斷一直依賴于病原的分離鑒定，OIE也一直采取的是進行病毒分離鑒定這個黃金標準。隨著血清學實驗技術和生物工程技術的飛速發展，禽流感診斷技術的研究也取得了新的進展。
對于禽流感傳統的病原學診斷方法是用雞胚或者狗腎細胞（MDCK）、雞胚成纖維細胞（CEF）等進行病毒分離，采用血凝和血凝抑制進行鑒定，血清學的診斷方法則包括中和試驗和瓊脂擴散試驗等。近年來，隨著免疫學和分子生物學技術的飛速發展，禽流感的診斷技術也越來越完善，現在已經有免疫印跡、免疫熒光、ELISA、墓因芯片、RT-PCR技術、熒光RT-PCR技術、NASBA技術等。
如果要檢驗是否是高致病性禽流感病毒，在進行HA亞型鑒定之后，還需要進行細胞培養、動物試驗或進行裂解位點的序列分析等進行判斷。因為OIE判斷HPAIV的標準是：①含流感病毒尿囊液，做l：10稀釋，靜脈內接種8只4～8周齡易感雞，每只0．2ml，如在10天內死亡6只以上，則該流感病毒為HPAIV~②如果致死l一5只易感雞，而且又不是H5或H7亞型，則將其接種雞胚成纖維細胞（CEF）或MDCK細胞，在沒有胰酶的情況下觀察是否產生細胞病理變化，如不產生病理變化，該流感病毒就不是HPAIV；③對于所有的低致病性H5和H7亞型病毒和其他流感病毒，如果在沒有胰酶的條件下在細胞培養能生長，則必須測定血凝素裂解部位的氨基酸順序，如果相似于其他的HPAIV，存在多個堿性氨基酸序列，則該受檢病毒被視為高致病性。
1．樣品采集
樣品采集的質量是進行禽流感檢測的關鍵。應從死禽和處于急性發病期的病禽采集樣品，樣品要具有典型性。采樣過程要注意無菌操作，同時避免污染環境。采樣人員要按NY／丁7（38要求加強個人防護。樣品的保存和運輸也要按照有關的規定和要求進行。
（1）病料樣品 至少從5只病禽和病死禽中采集病料樣品（發病群不足5只則全部采樣）。樣品應包括：泄殖腔（新鮮糞尿樣）棉拭子和氣管棉拭子（置于緩沖液中）；氣管和肺的混樣；腸管及內容物的混樣；肝、脾、腎和腦等其他組織樣品（不能混樣）。
組織樣品、氣管棉拭子單獨放人容器，容器中盛放含有抗生素（pH值為7．0～7．4）的PBS液。抗生素的選擇應視當地情況而定，組織和氣管拭子懸液中加入青霉素（20001U／ml）、鏈霉素（2mg／ml）或慶大霉素（50t~g／m1）。腸管及內容物、糞便樣品和泄殖腔棉拭子所用的抗生素濃度應提高5倍（加入抗生素后PBS液的pH值應調至7．0-7．4）。
（2）血樣 分別采集至少10個病禽的（急性發病期血清，如發病群不足10只則全部采樣），并要求單獨存放，不能混合。
2．病毒的分離鑒定
以無菌拭子采集氣管或泄殖腔病料或病變組織，研磨制成10％懸液，經處理后接種9-11日齡SPF雞胚，收獲尿囊液測定血凝活性，若為陰性則應繼續盲傳2～3代。對具有血凝活性的尿囊液需先用ND抗血清做HI試驗，以排除新城疫的可能，即使ND陽性也應采用中和法繼續傳代，看是否為ND與AIV混合感染。然后用免疫擴散等方法來檢測特異性核心抗原NP或MP，然后用血凝抑制試驗和神經氨酸酶抑制試驗鑒定A型流感病毒亞型。分離鑒定的同時，進行致病力試驗，確定毒力的強弱。
雞胚培養法的優點 雞胚的組織分化程度低，可選擇適當途徑接種，病毒易復制，感染病毒的膜和液體含大量病毒；雞胚是個整體，有神經血管的分布及臟器的構造；來源充足，操作簡單，通常是無菌的，對接種的病毒不產生抗體。3天可報告結果。病毒分離鑒定對AI的診斷比較確實，但操作程序繁雜，費用高，耗時費力。