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技術(shù)文章

IL-8的誘生與IL—8的免疫學(xué)檢測(cè)

閱讀:502          發(fā)布時(shí)間:2012-5-12

IL-8由單核/巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生,其主要生物活性是激活中性粒細(xì)胞。
多用人外周血或臍帶血單個(gè)核細(xì)胞,也可用體外培養(yǎng)傳代細(xì)胞系。LPS、PHA、ConA、IL-i、TNFa均是較理想的刺激劑。
1.常規(guī)分離PBMC,洗滌后,調(diào)整細(xì)胞濃度為5X106/mL。
2.加入終濃度為1ug/mL的LPS及10mg/mL的PI-IA,混勻后置37%,5%C02溫箱中培養(yǎng)48h,離心收集上清。
3.用HCl將培養(yǎng)上清調(diào)為酸性(pI-14.0),經(jīng)SephadexG-75柱分離,收集活性組分即為IL-8粗制品。

免疫學(xué)檢測(cè)法
1.雙抗體夾心法ELISA 同常規(guī)夾心法ELISA。
2.原位免疫細(xì)胞化學(xué)測(cè)定法 該法用于測(cè)定細(xì)胞漿內(nèi)IL-8含量。首先將待測(cè)細(xì)胞(如皮膚成纖維細(xì)胞)培養(yǎng)于平皿中的蓋玻片上,加入適當(dāng)?shù)拇碳ㄈ鏘OOU/mL的hlL-1。),共孵育一定時(shí)間;將載玻片取出,空氣干燥后在丙酮中固定10min;將蓋玻片粘附于載玻片上,加入適當(dāng)濃度的抗IL-8McAb,室溫反應(yīng)30rain,沖洗后加入酶標(biāo)的第二抗體,沖洗后加底物顯色,顯微鏡下觀察。

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