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細胞受體結合免疫測定CIC法
閱讀：616 發布時間：2012-2-4細胞受體結合免疫測定法是根據CIC可與某些細胞表面的Fc受體或補體受體結合而建立的細胞技術，這類方法有靈敏度較高，特異性較強等優點，但需進行活細胞培養或細胞分離，影響因素多，重復性較差，目前僅適用于實驗研究。此類技術有多種方法。
Raji細胞是從Burkitt淋巴瘤患者分離建株的B淋巴細胞系。可在體外連續傳代培養，細胞表面沒有膜免疫球蛋白，Pc受體的親和力很低，但有C3、C3b和C3d受體及Clq受體，而且不易脫落。因此能使結合補體的IC吸附在細胞上，然后再于反應系統中加入熒光素或i125標記的抗人IgG抗體，使其與結合在Raji細胞上的IC中的IRC反應，計算Rail細胞上結合的IC中滲入的核素量，即可判定IC的存在與含量。
(一)試劑
1．Raji細胞懸液 將Raji細胞培養在含20％小牛血清的RPMI-1640培養液中2—3d后即可收集應用，該細胞培養時不貼壁、不結團，生長容易(一般3d即可傳一代)，培養條件不苛求。但pH值應在6．5左右，超過pH7．0則生長不良。收集細胞時要計數和檢查活細胞，臺盼藍排除試驗要求活細胞在95％以上。
2．核素標記抗IgC抗體 將兔抗人IgC血清經DE52分離兔IsC，用PBS稀釋成蛋白質1mg／mL，按每ug蛋白質結合0．3uCi125I標記抗人IgC抗體。
(二)操作步驟
1．取培養72h的Raji細胞1 800r／rain離心10rain，棄去上清液，細胞沉淀中加入不含小牛血清的1640培養液，洗2次。
2．計數Raji細胞數，用*1640培養液配成107／mL細胞懸液。
3．取1滴細胞懸液加等量0．1％臺盼藍，放37℃10rain，鏡檢著色細胞不應超過5％。
4．在試管中加入細胞懸液501~L，再加入1：4稀釋的受檢血清25uL。
5．搖勻后放37~(2 45rain，每5-10rain輕搖一次，使其充分作用。
6．用1640培養液將細胞洗滌3次，1 000r／min離心5min，棄去上清液。
7．在細胞沉淀物中加125I標記的抗人TgG抗體，用含1％人血清白蛋白(HSA)的1640培養液將標記物稀釋成7-10ug／mL。加入標記物后置4℃30min，每間隔5—10min輕搖1次。
8．用含1％人血清白蛋白(HSA)的1640培養液洗滌3次，每次1 800r／rain離心10min。
9．取細胞沉積物用Y計數器測cpm值。
10．用熱變性IgG40ug溶于50uL新鮮混合人血清中，然后倍比稀釋成10個稀釋度，按上述方法操作測定cpm。
(三)結果判斷
以熱聚合IgC的含量為橫坐標，cpm為縱坐標繪制標準參考曲線。自參考曲線查出IC中IgC的ug數，按ug/mL報告。
(四)注意事項
1．Raji細胞有時也帶有Pc受體和表面膜免疫球蛋白，為使實驗結果反映真實情況，應預試條件，同時在實驗中加陰性對照。
2．用熱變性IsC作對照和參考時，一定要用新鮮血清作稀釋劑，以補充補體。
除此以外，細胞受體結合免疫測定方法中的血小板凝集試驗亦用于實驗研究。其原理是免疫復合物與血小板相互作用后引起血小板表面發生改變，導致血小板凝集(有人認為血小板凝集與其表面Fc受體活化有關)。試驗中必須采用新鮮分離的有活力的血小板，因為在IC存在時，血小板表面的改變有賴于其代謝狀態。除IC外，高濃度的游離免疫球蛋白與血小板表面抗原反應的抗體和其他物質，如荷電分子、蛋白水解酶和某些粘病毒也可使血小板聚集；Clq、IgM、RF能抑制IC引起的血小板聚集；待檢血清于試驗前加熱滅活，會使其血小板凝集滴度升高或降低。