化工儀器網(wǎng)
技術(shù)文章
DNA為基礎(chǔ)的方法檢測飼料中的動物源性
閱讀：573 發(fā)布時(shí)間：2011-1-8以檢測DNA為基礎(chǔ)的方法主要有核酸探針雜交、DNA指紋分析、PCR-RFLP分析、PCR特異擴(kuò)增（常規(guī)PCR方法和Real-time PCR方法）。其主要原理都是對各物種內(nèi)特異的核酸序列進(jìn)行提取、鑒定，從而判定飼料內(nèi)有無該物種的成分，只是結(jié)果判別的信號條件不同。
核酸探針雜交方法的原理是堿基配對，即一條DNA鏈能與它的特異互補(bǔ)鏈配對形成雙鏈DNA。因此，用一個(gè)熒光物質(zhì)或放射性物質(zhì)標(biāo)記的單鏈核苷酸探針能夠很快地從許多其他DNA分子的混合物中檢測出它的互補(bǔ)單鏈。由于雜交探針需要用熒光物質(zhì)或放射性物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，所以該法在實(shí)際檢測中很少應(yīng)用。
動物基因組中存在大量的分散重復(fù)序列（interspersedrepeat sequence，IRS），并且是種間高度特異的，DNA指紋分析就是通過用哺乳動物中廣泛存在的分散重復(fù)序列的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，建立從牛到鴕鳥的30多種哺乳動物的DNA指紋圖譜，來對飼料中的動物源性成分的DNA進(jìn)行鑒定。由于DNA指紋有一定難度，所以該法在實(shí)際檢測中也較少應(yīng)用。
PCRRFLP（限制性內(nèi)切酶多態(tài)性分析）方法是用引物進(jìn)行擴(kuò)增，然后對擴(kuò)增片段用限制性內(nèi)切進(jìn)行酶切，利用限制性內(nèi)切酶的多態(tài)性進(jìn)行檢測。由于使用的限制性內(nèi)切酶對PCR產(chǎn)物進(jìn)行限制性內(nèi)切酶切分析不方便，所以該法在實(shí)際檢測中應(yīng)用較少。
PCR特異擴(kuò)增方法由于其簡單、快速、特異性強(qiáng)成為目前zui廣泛應(yīng)用的方法，特別是熒光PCR（或稱為Real-timePCR）的應(yīng)用使得檢測的特異性和敏感性更高。Tartaglia*次設(shè)計(jì)了PCR試驗(yàn)，將其用于肉骨粉以及飼料中的反芻動物源性成分的檢測。他所選的目標(biāo)片斷是線粒體DNA中編碼tRNAlys和ATP合成酶8亞基和6亞基的片段，高等植物中未發(fā)現(xiàn)其同源序列，采用異硫氰酸胍和二氧化硅方法提取DNA，肉骨粉的檢出的含量的zui低限為0．125％，我國的出入境檢驗(yàn)檢疫系統(tǒng)根據(jù)該方法制定了檢測肉骨粉中牛源性、羊源性成分的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。
但是，隨后對PCR方法的驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)這一方法有其缺陷，因?yàn)榧庸み^程中的熱處理使得大量DNA被嚴(yán)重降解，分解成小片段，有數(shù)據(jù)表明當(dāng)肉被加熱到100~C時(shí)，其中的DNA就被降解到1100bp至300bp左右。若設(shè)計(jì)的目的片段太長則可能無法擴(kuò)增出來，這在許多人的報(bào)道中被證實(shí)。因此，需要設(shè)計(jì)比較小的目的片段，同時(shí)要選擇細(xì)胞內(nèi)含量比較多的目標(biāo)片段。目前所建立的PCR方法中以線粒體DNA中的細(xì)胞色素b與tRNAlysATP合成酶亞基8和亞基6的片段為目標(biāo)區(qū)域的較多，線粒體基因的其他部分（如D—loop區(qū)域），還有其他核酸序列（如衛(wèi)星DNA、actln基因、SINEs序列和LINEs序列、生長素基因等）也被作為檢測的目的基因。
線粒體編碼的長度為60-70bp的片段已經(jīng)被作為一些物種的目標(biāo)片段進(jìn)行檢測，由于這些片段比較小，用瓊脂糖電泳檢測非常不方便，但用熒光PCR檢測可以避免這些問題。Real—tmmPCR中使用的TaqMan技術(shù)是在引物的基礎(chǔ)上又添加了一條探針，只有在探針與擴(kuò)增出的目標(biāo)片段結(jié)合時(shí)，才發(fā)出熒光信號，可以根據(jù)發(fā)出的熒光對反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測，比經(jīng)典的PCR方法特異性高，這是因?yàn)橛幸锖吞结槍δ繕?biāo)進(jìn)行雙重篩選。有資料表明用這項(xiàng)技術(shù)對幾種動物成分進(jìn)行了檢測，在所有樣品中動物的成分都可清楚地檢測到，這一結(jié)果說明，肉骨粉經(jīng)過加工后，即使溫度達(dá)到141~C，也有足夠的DNA可通過Real—time PCR技術(shù)檢測到，而當(dāng)目標(biāo)片段設(shè)計(jì)為275bp或350bp時(shí)，所有的樣品都檢測不到。同時(shí)對于目前的定性檢測，利用不同的探針和染料可以做到一個(gè)反應(yīng)內(nèi)檢測多個(gè)動物品種。
PCR方法在檢測大多數(shù)生產(chǎn)條件下生產(chǎn)的飼料，至少在歐盟法定的條件下生產(chǎn)的肉骨粉是有效的，但生產(chǎn)過程的多樣性導(dǎo)致了基因物質(zhì)的不同降解水平，因此不同的生產(chǎn)條件都會對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響，擴(kuò)增的片段大小也會對檢測的靈敏度產(chǎn)生影響。PCR的缺點(diǎn)還表現(xiàn)在必須的刻防止交叉污染，并且這個(gè)方法無法檢測動物DNA的來源，因?yàn)槿夤欠鄣某霈F(xiàn)與陽性信號的出現(xiàn)并無直接關(guān)系，乳汁、血液、脂肪都有可能是DNA的來源。PCR方法相對來說是一種比較昂貴的方法，不僅試劑貴而且也需要比較昂貴的儀器，特別是熒光PCR儀。