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PCR參數設定的基本原則
閱讀：3086 發布時間：2010-12-23一個PCR反應開始，首先是雙鏈DNA解離為單鏈，使之有利于與引物結合過程可以通過加熱來完成。在90—95℃條件下，即使復雜的DNA分子，如人基因組DNA也可變性成單鏈，根據模板DNA復雜程度，可以調整變性溫度和時間。一般情況下選擇94‘C、30s可使各種復雜DNA分子*變性。過高溫度或持續時間過長，對TaqDNA聚合酶活性和dNTP分子都會造成損害。
變性后的DNA很快冷卻至40～60℃，即可使引物和模板DNA發生結合。這是由于模板DNA結構比引物復雜得多，引物和模板之間碰撞的機會大大高于模板互補鏈之間的碰撞。復性溫度的選擇，可以根據引物的長度和其G-+-C含量確定。引物長度為15～25bp時，退火溫度可通過Tm＝4X（G+C）+2X（Ad-T）計算得到。在Tm允許的溫度范圍內，選擇較高的退火溫度可大大減少引物和模板之間的非特異結合，提高
PCR的特異性。退火時間設置為30s，足以使引物和模板之間*結合。
PCR反應的延伸溫度為70—75℃，此時，TaqDNA聚合酶具有zui高活性。引物在16個核苷酸以下時，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結合。可采用反應溫度緩慢升高到70～75℃的方法。因為在zui初較低溫度下，DNA聚合酶已催化延伸反應開始，隨后的較高溫度不會對“延長”過的引物和DNA模板的結合發生影響。PCR延伸反應的時間，可根據待擴增片段的長度而定。一般lkb以內的片段，延伸時間lmin足夠。擴增片段在lkb以上則需增加延伸時間。
以上參數確定后，PCR循環次數主要取決于模板DNA的濃度。理論上20～25次循環后，PCR產物的積累即可達到zui大值。實際操作中由于每步反應的產率不可能達到*，因此不管模板濃度多少，20～30次是比較合理的循環次數。循環反應的次數越多，非特異性產物的量也會增加。