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RT-PCR
閱讀：2593 發(fā)布時間：2010-12-9cDNA產(chǎn)量的很低
A: RNA模板質(zhì)量低
B: 對mRNA濃度估計過高
C: 反應(yīng)體系中存在反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑或反轉(zhuǎn)錄酶量不足
D: 反應(yīng)體積過大
2. 擴增產(chǎn)物在電泳分析時沒有條帶或條帶很淺
A: zui常見的原因在于反應(yīng)體系是PCR的反應(yīng)體系而不是RT-PCR的反應(yīng)體系
B: 與反應(yīng)起始時RNA的總量及純度有關(guān)
C: 建議在試驗中加入對照RNA
D: *鏈的反應(yīng)產(chǎn)物在進(jìn)行PCR擴增時，在總的反應(yīng)體系中的含量不要超過1/10
E: 建議用Oligo（dT）或隨機引物代替基因特異性引物（GSP）用于*鏈合成。由于RNA模板存在二級結(jié)構(gòu)，如環(huán)狀結(jié)果，有可能導(dǎo)致GSP無法與模板退火；或SSⅡ反 轉(zhuǎn)錄酶無法從此引物進(jìn)行有效延伸。目的mRNA中含有強的轉(zhuǎn)錄中止位點，可以試用以下方法解決.
a. 將*鏈的反應(yīng)溫度提高至50℃。
b. 使用隨機六聚體代替Oligo（dT）進(jìn)行*鏈反應(yīng)
3. 產(chǎn)生非特異性條帶
A: 用RT陰性對照檢測是否被基因組DNA污染。如果RT陰性對照的PCR結(jié)果也顯示同樣條帶，則需要用DNase I重新處理樣品。
B: 在PCR反應(yīng)中，非特異的起始擴增將導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性結(jié)果。降低鎂離子或是目的DNA的量將減少非特異性結(jié)果的產(chǎn)生。
C: 由于mRNA剪切方式的不同，根據(jù)選擇引物的不同將導(dǎo)致產(chǎn)生不同的RT-PCR結(jié)果。
4. 產(chǎn)生彌散（smear）條帶
A: 在PCR反應(yīng)體系中*鏈產(chǎn)物的含量過高
B: 減少引物的用量
C: 優(yōu)化PCR反應(yīng)條件/減少PCR的循環(huán)次數(shù)
D: 在用DNase處理被DNA污染的RNA樣品時，其產(chǎn)生的寡核苷酸片段會產(chǎn)生非特異性擴增，一般會顯示為彌散背景。
5. 產(chǎn)生大分子量的彌散條帶
大多數(shù)情況下是由于退火溫度過低而導(dǎo)致的非特異性的起始及延伸產(chǎn)生的對于長片段的PCR，建議將反應(yīng)體系中cDNA的濃度稀釋至1:10（或1:100-1:200）
6. 在無反轉(zhuǎn)錄酶的情況下，對照RNA獲得擴增結(jié)果
A: 通常是由于對照RNA中含有痕量DNA而導(dǎo)致的。由于進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄時不可能將所有的DNA模板消除。建議可將*鏈cDNA稀釋1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成的影響。
B: 有可能是引物二聚體的條帶
7. 擴增產(chǎn)物滯留在加樣孔中
A: 有可能是由于模板量過高而導(dǎo)致PCR結(jié)果產(chǎn)生了高分子量的DNA膠狀物。B: 建議將*鏈結(jié)果至少稀釋100倍再進(jìn)行二次擴增。
C: 另外，在二次PCR時使用的退火溫度如果比引物的Tm值低5℃，可以將退火溫度適當(dāng)增高或進(jìn)行熱啟動以提高特異性。
8. 為什么使用基因特異性引物（GSP）？
GSP在擴增低豐度的轉(zhuǎn)錄本時是的。OligodT引物建議用于高質(zhì)量RNA及全長轉(zhuǎn)錄本的逆轉(zhuǎn)錄；隨機引物用于mRNA片段的逆轉(zhuǎn)錄。
9. 什么情況下需要使用RNase H？
在*輪PCR中RNA/DNA雜合體不能正常變性時10. 根據(jù)不同的目的選擇不同的系統(tǒng)：
| 目的 | 建議 |
| RT與PCR使用不同的引物 或需要靈活選擇PCR DNA聚合酶 | 兩步法RT-PCR系統(tǒng) |
| 高靈敏度 | 一步法或兩步法系統(tǒng) |
| 高特異性 | 含有適當(dāng)?shù)腄NA聚合酶的兩步法系統(tǒng) 或具有高保真Platinum Taq酶的一步法系統(tǒng) |
| 高保真度 | 含有Pfx Taq酶的兩步法系統(tǒng) |
| 長的反轉(zhuǎn)錄結(jié)果 | 通常使用兩步法系統(tǒng)可達(dá)到*結(jié)果 含Elongase酶的一步法系統(tǒng) |
RACE
1.如何設(shè)計基因特異性引物（GSP）？
使用5’或3’RACE試劑都需要至少一條基因特異性引物，您在設(shè)計引物時需要注意以下幾點要求：
A: 50-70％的GC含量，以提高引物熔點（Tm）
B: 23-28個堿基長度，以提高引物特異性
C: 降低3’端GC含量，將引物非特異性結(jié)合的可能性降至zui低
2. 為什么得不到RACE產(chǎn)物？
A: 加入Hela對照
B: 低質(zhì)量的RNA模板
C: 逆轉(zhuǎn)錄失敗，SSII和SSIII非常適用于長模板cDNA的合成
D: 目的基因豐度太低，可以通過提高PCR的循環(huán)次數(shù)來解決，建議使用巢式PCR
E: 目的基因沒有表達(dá)，可以通過使用兩條GSPs來分析cDNA中是否含有目的基因
F: 目的基因太長而不適合進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，建議使用Oligo dT來得到全長cDNA，使用隨機引物或與模板的5’端盡可能近的GSP進(jìn)行PCR。
G: cDNA模板屬于困難模板，可以通過以下方法解決：優(yōu)化PCR反應(yīng)參數(shù)及反應(yīng)體系；降低退火溫度；使用5-10％的DMSO幫助通過高GC含量區(qū)；使用高保真度和高延伸能力的酶進(jìn)行PCR反應(yīng)。
3. RACE的PCR結(jié)果有雜帶
RACE PCR雜帶或非特異性PCR條帶可能是由于以下原因：
A: GSP與其他cDNA的非特異性結(jié)合會導(dǎo)致在擴增目的產(chǎn)物時得到無關(guān)產(chǎn)物。
B: 引物和cDNA的非特異性結(jié)合會導(dǎo)致產(chǎn)生一端帶有引物序列的PCR產(chǎn)物。
C: RNA降解。
D: PCR管或試劑污染。
注意：雜帶一般是因為沒有優(yōu)化PCR條件，可以加入陰性對照來確定。
4. 得不到全長的5’RACE PCR產(chǎn)物
A: CIP反應(yīng)后的RNA降解產(chǎn)生了新的帶有5’磷酸的斷裂模板，可以同RACE RNA Oligo連接。一定要小心操作，保證RNA無降解。
B: CIP脫磷酸不*，可以增加反應(yīng)中CIP的量或減少RNA的量.
C: PCR產(chǎn)生了雜帶，并不是真正的連接產(chǎn)物，可以使用上述建議優(yōu)化PCR。