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技術(shù)文章
標(biāo)記蛋白的概述
閱讀：2904 發(fā)布時(shí)間：2010-11-24從建立了克隆表達(dá)技術(shù)以來(lái)，將2個(gè)編碼區(qū)域融合構(gòu)建一個(gè)具有2個(gè)起始多肽特性的新蛋白， 已廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究中。下圖利用來(lái)源于c-myc蛋白表位結(jié)構(gòu)的詳細(xì)知識(shí)，構(gòu)建了一個(gè)可供商品化抗體識(shí)別的新蛋白。這種方法已經(jīng)成為分子克隆的主要技術(shù)，任何新識(shí)別的編碼區(qū)均可通過(guò)在多肽上加一個(gè)表位序列，即可被特異性抗體識(shí)別。亦可將其他感興趣的蛋白或功能區(qū)的編碼基因與研究中的抗原基因融合，如將所研究的蛋白質(zhì)編碼基因與谷胱甘肽—S—轉(zhuǎn)移酶（GST）基因融合，并可在E．coli中合成一個(gè)可溶性蛋白，該蛋白可通過(guò)與谷胱甘肽珠結(jié)合得到純化。目前已有許多有價(jià)值的其他純化標(biāo)記物得到了廣泛的應(yīng)用。新近GFP融合技術(shù)的應(yīng)用，更加豐富了這一領(lǐng)域的內(nèi)容，該技術(shù)通過(guò)使用非免疫的檢測(cè)方法對(duì)蛋白進(jìn)行定位。這一技術(shù)的發(fā)展為蛋白標(biāo)記物的應(yīng)用提供了新的方式。
采用DNA重組技術(shù)對(duì)蛋白進(jìn)行標(biāo)記，并可在不同的宿主細(xì)胞系統(tǒng)中對(duì)其進(jìn)行純化和特異性檢測(cè)，包括為進(jìn)行檢測(cè)（如綠色熒光蛋白標(biāo)記物，GFP）或純化（如His標(biāo)記物和谷胱甘肽—S—轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記物）而設(shè)計(jì)的特異性標(biāo)記物。目前已經(jīng)制備出與短肽序列（表位標(biāo)記物）結(jié)合力較強(qiáng)且特異性高的抗體，標(biāo)記蛋白已被廣泛應(yīng)用，并已建立了為蛋白的調(diào)節(jié)、結(jié)構(gòu)和功能研究的新方法。
傳統(tǒng)的方法多以放射性同位素或熒光染料標(biāo)記蛋白，標(biāo)記過(guò)程中要求有純化的蛋白質(zhì)。通過(guò)DNA重組方法標(biāo)記蛋白是一重大的技術(shù)發(fā)展，該方法在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中將標(biāo)記物（1abel或tag）直接連接到蛋白質(zhì)上。標(biāo)記物本身是一個(gè)小的開(kāi)放閱讀框，在研究中，采用分子生物學(xué)技術(shù)將其與目的蛋白融合。
DNA重組技術(shù)的先進(jìn)性在于可在各種表達(dá)系統(tǒng)中制備和檢測(cè)標(biāo)記蛋白，并可通過(guò)標(biāo)記物對(duì)雜交蛋白進(jìn)行檢測(cè)和純化。目的蛋白可與綠色熒光蛋白）或谷胱甘肽—S—轉(zhuǎn)移酶蛋白（GSF）等標(biāo)志物融合，或與一些短肽，如His標(biāo)記物以及能夠與鏈霉親和素結(jié)合的標(biāo)記物融合，其中短肽可與特定的配體結(jié)合。
肽標(biāo)記的另一方法是表位標(biāo)記，即將1個(gè)短的氨基酸序列插入到靶蛋白編碼區(qū)，其氨基酸序列可與已知的單克隆抗體或多克隆抗體結(jié)合，從而可采用各種免疫技術(shù)檢測(cè)和純化標(biāo)記的靶蛋白，因已有商品化的特異性針對(duì)標(biāo)記物的抗體。
DNA重組標(biāo)記技術(shù)的成功是因?yàn)闃?biāo)記并不改變被標(biāo)記蛋白的功能，特別有兩大進(jìn)展使得標(biāo)記技術(shù)切實(shí)可行：①通過(guò)合成寡核苷酸和PCR技術(shù)將標(biāo)記物插入到蛋白表達(dá)載體中；②在病毒、細(xì)菌、植物、酵母、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)中可表達(dá)重組標(biāo)記蛋白。應(yīng)用針對(duì)5～10個(gè)氨基酸線(xiàn)性表位的單克隆抗體對(duì)表位作圖，為實(shí)驗(yàn)研究提供了大量標(biāo)記物，從而可以同時(shí)對(duì)多種不同的標(biāo)記蛋白活性進(jìn)行分析。
標(biāo)記的*步是獲得編碼蛋白質(zhì)的基因克隆和經(jīng)過(guò)測(cè)序的開(kāi)放閱讀框，并具備分子生物學(xué)技術(shù)知識(shí)和工作經(jīng)驗(yàn)，包括克隆、測(cè)序和PCR技術(shù)。這些方法在Sambrook等（1989）的著作中有詳細(xì)描述。
標(biāo)記物一般用于兩個(gè)目的：①蛋白檢測(cè)：即標(biāo)記物的引入使得能夠檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中的標(biāo)記蛋白，從而可對(duì)蛋白的功能、蛋白質(zhì)在細(xì)胞的定位以及相互作用和生化活性進(jìn)行研究；②蛋白純化：即選擇一種可以與某種固相化配體結(jié)合的標(biāo)記物，從而可以從細(xì)胞抽提物中批量純化蛋白。