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采用PCR技術插人表位標記物
閱讀：1041 發(fā)布時間：2010-11-24 許多表達載體可能沒有能夠克隆標記物的合適的限制性酶切位點。在這種情況下，采用PCR技術將多肽標記物插入到已經(jīng)克隆化的開放閱讀框。在設計PCR正向和反向引物時，可引入較長的片段以在蛋白的氨基或羧基末端引入多肽標記物。，選擇用于編碼標記物特定氨基酸的密碼子，使其能夠用于表達標記蛋白的生物系統(tǒng)中。引物設計時應加入新的限制性酶切位點，以便PCR產物的克隆。應在引物限制性部位5，端添加額外的堿基，這些“增添”的堿基有利于限制酶對PCR產物進行有效的切割。同時需注意保持正確的閱讀框和根據(jù)需求設計起始密碼和終止密碼子。使用Kozak的保守翻譯起始序列5，—CCACCATGG-3’代替單一的ATG起始密碼，可在真核細胞中進行有效的翻譯。稍為復雜的PCR程序可以將肽標記物為一個閱讀框內融合蛋白形式，插入到開放閱讀框的任何一個部位。這些技術在許多克隆手冊中均有描述，在此僅給出一個簡單的例子以說明應考慮的因素。
舉例：采用PCR技術將HA標記物插入到周期素（cyclin）結合蛋白的氨基末端并在正。coli中表達
設計PCR的正向引物（氨基末端HA標記物）有3個目的：
（1）編碼HA標記物；
（2）與周期素結合蛋白YFP2開放閱讀框的5，端雜交；
（3）創(chuàng)建新的限制性酶切位點以便將編碼新的標記蛋白的PCR產物克隆到表達載體中。
當標記氨基末端時，需要創(chuàng)建一個新的起始甲硫氨酸以避免破壞正確的翻譯起始信號。如果克隆到真核系統(tǒng)中進行表達，則需在此處引入Kozak保守序列，在本例選用（pET-）作為表達質粒。
1．表位標記物的序列
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
Y P Y D V P D Y A
選擇E．coli和人類常用的密碼子。
TAC CCA TAC GAC GTG CCA GAC TAC GCT
選擇一段重疊序列，將標記物置于YFP2的氨基末端。通常有18～21bp的重疊序列即可。希望Tm溫度在55～80℃之間，盡可能避免連續(xù)3個C或G，且避免引物在3，端互補或者具有明顯的二級結構?？墒褂密浖绦蜻M行正確的引物設計。但是，一個簡單的經(jīng)驗是，每對AT提供2℃熔鏈溫度，而每對GC提供4℃熔鏈溫度。
2．YFP2的氨基末端
ATG GAC CCG GCG GCG GGG AGC
M D P A A G S
然后再創(chuàng)建限制性酶切位點。在本例中，所創(chuàng)建的位點并不在開放閱讀框中：本例選擇創(chuàng)建一個NdeI酶切位點，以編碼起始甲硫氨酸和有利于克隆到表達載體中。同時，添加GC以利于對PCR產物進行有效的限制性消化和防止PCR產物末端的破裂。
GC CATATG
結合上述要素，設計正向引物，預定以下寡核苷酸
5，—GC CATATGTAC CCA TAC GAC GTG CCA GAC TAC GCT ATG GAC CCG GCG GCG GGGAGC-3，
反向引物可設計成為開放閱讀框的末端引物，并創(chuàng)建一個適當?shù)南拗菩悦盖形稽c。
3．YFP2在羧基端的序列
GGT CCC TCA GAC ATC CCC GAT TGA
G P S D I P D x
4．因與基因的該區(qū)域雜交并創(chuàng)建一個在片段另一端進行克隆所需EcoRI酶切位點的反向引物
GC GAA TTC TCAATC GGG GAT GTC TGA GGG ACC
為使用現(xiàn)有的編碼YFP2基因的質粒作為模板進行PCR，需要根據(jù)所使用的具體設備，仔細地進行優(yōu)化，以設計合適的反應條件；這些優(yōu)化程序可以參見Dieffenbach和Dveksler（1995）的文獻。
如果得到大小正確的產物，就可將產物從凝膠中切下，使用PCRprepDNA純化系統(tǒng)進行純化，然后以EcoRI和NdeI進行限制性消化，并連接到經(jīng)過適當處理的載體上去。在本例中，克隆到可在正．coli中表達的且含有合適酶切位點的pET-載體上。NdeI部位提供了起始甲硫氨酸。
5．新的氨基端
M Y P Y D V P D Y A M D P A A G S。。。
|————一標記物——一|——YFP2——